弧菌对养殖大菱鲆的危害及其防治方法研究新进展

黄华 陈坤 于文松 高雁 王亮 王晓飞 王鹤

(烟台市海洋经济研究院，山东烟台 264006)

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)又名多宝鱼，原产于欧洲，于1992年引进我国[1]。大菱鲆具有生长速度快、耐低温、饲料转化率高、肉质鲜美可口等优点，因而逐渐成为我国沿海地区重要的海水养殖鱼类。到2005年，我国大菱鲆工厂化养殖规模已跃居全球首位，养殖产量占世界大菱鲆养殖总量的87.5%，在进出口贸易中发挥着重要作用[1-2]。经历了2006年的“多宝鱼风波”后，在政府调控和各界努力下，次年大菱鲆产业规模得到恢复，逐渐进入平稳发展阶段。但是，随着工厂化养殖的发展，由于养殖规模和养殖密度的不断增大、管理人员经验不足、苗种质量低、地下海水水质多样等问题，大菱鲆养殖早期出现的病害依旧较多，每年都会因病害导致较大的经济损失。在已报道的大菱鲆寄生虫病、细菌性疾病、病毒性疾病等各类疾病中，细菌性疾病发生的频次最高，损失也较严重，其中尤以弧菌病发生频次最高[3]。

大菱鲆弧菌病的病原弧菌属(Vibrio)是一类革兰氏阴性菌，普遍存在于河口、沿海海域的海水中以及海洋动物的体表和体内，在养成期大菱鲆的肠道微生物中所占比例最大[2]。弧菌属的大部分种类是海洋环境或一些海洋动物中正常有益菌的组成部分，小部分能引发疾病。在我国近30年的大菱鲆养殖业发展中，对大菱鲆弧菌病的报道屡见不鲜。研究发现，能够使大菱鲆致病的弧菌属种类主要有鳗弧菌(Vibrioanguillarum)[4-7]、哈维氏弧菌(V.harveyi)[8-9]、大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)[10]、溶藻弧菌(V.alginolyticus)[11]、鲨鱼弧菌(V.carchariae)[12]、创伤弧菌(V.vulnificus)[13]、灿烂弧菌(V.splendidus)[14]、海利斯顿氏弧菌(V.pelagius)[5,15]、美人鱼弧菌(V.damsela)[16]等。

我国弧菌病发病地区涵盖了山东[6]、河北[5]、辽宁[13]等沿海大菱鲆养殖地区。患弧菌病的大菱鲆，其临床表现各不相同，主要有体色变黑、鳃丝呈灰白色、腹部肿胀、鳍基部充血、口部充血发红等。严重感染的病鱼体表溃疡、出血，解剖可见肝脏充血、脾肿大和肠道肿胀等症状[3]。

本文介绍几种常见的弧菌病原对养殖大菱鲆的危害，并对近年来有关大菱鲆弧菌病新的检测及防治方法进行总结，以期为该病的进一步研究提供参考。

1 常见弧菌病原对养殖大菱鲆的危害

1.1 鳗弧菌

鳗弧菌普遍存在于我国的大菱鲆养殖区，具有流传面积广、速度快等特点，能通过鳍、鳃、皮肤、肠道等多种途径感染大菱鲆，引发腹水病、出血症、烂鳍病等[4,17]。病鱼通常会表现出食欲减退，体表变色、浮肿、溃疡出血，腹部膨大有腹水，胸鳍、侧鳍和尾鳍先发白后溃烂，鳍基部有红斑，解剖可见内脏充血、脾肿大等症状[17]。患烂鳍病的大菱鲆，从鳍发白到死亡仅仅需要几天时间。幼苗期及各个养成时期的大菱鲆都可能患烂鳍病[4]。

溶血素具有溶血性、细胞毒性和动物致死性等特性[18]。在鳗弧菌的毒力研究中发现，VAH1、VAH2、VAH3、VAH4、VAH5等胞外溶血素[19]及RTX系列蛋白是鳗弧菌的主要毒力因子，在侵染宿主的过程中起到穿孔作用[20]。鳗弧菌有10个O抗原型，其中O1型、O2型和个别O3型与水产动物弧菌病有关，最常报道造成大规模死亡的是O1型和O2型抗原型[21]。

1.2 哈维氏弧菌

哈维氏弧菌是海水养殖鱼类的常见致病菌，通过鳃、口、体表等途径感染养殖动物[22]。Iddya等[23]报道，哈维氏弧菌能在不同非生物基质表面上形成生物被膜。该菌能引发养殖大菱鲆患溃疡症、腹水病等。人类误食含有哈维氏弧菌的水或食物后易罹患腹泻、败血症、中耳炎等疾病[24]。

感染哈维氏弧菌后患溃疡症的养殖大菱鲆会出现体表病灶部位出血、肌肉溃烂、眼球凸出等典型症状。临床初期表现为病鱼不摄食，缓慢浮游于养殖池的边缘，鳃丝溃烂、黏鳃，体表的病灶部位稍有发白，部分病灶部位充血发红。中后期病鱼的头部、鳃盖边缘、上下体侧的鳍基部溃烂，形成溃疡面或深洞。解剖可见鳃丝贫血，胆囊、肾脏肿大，肝脏充血，肠壁充血并呈透明状，肠内有淡黄色液体。养殖大菱鲆一般在发病1周左右死亡[8]。

1.3 大菱鲆弧菌

大菱鲆弧菌是大菱鲆肠道中的优势菌[25]，属于条件致病菌[26]。当大菱鲆受环境胁迫、患消化道疾病或被其他病原菌感染后，大菱鲆弧菌可转为致病菌[27]，引发大菱鲆腹水症[10]、肠炎病[27]等。感染大菱鲆弧菌后患肠炎的大菱鲆，解剖可见其肠壁明显充血，呈红色，肠道中有大量黏液和黄白色粪便。大菱鲆弧菌分高毒株和低毒株，菌株之间毒性差异较大[28]。对大菱鲆弧菌毒力因子的研究表明，该菌的胞外产物有碱性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶等多种活性蛋白酶[28]。大菱鲆弧菌的致病能力与胞外产物、黏附因子、脂多糖及某些外膜蛋白等有关。

1.4 溶藻弧菌

溶藻弧菌又名溶藻胶弧菌，属革兰氏阴性短杆菌，是我国近海海水养殖中常见的病原菌[29]，也是人兽共患的病原菌[30]。溶藻弧菌能引起大菱鲆苗种[31-33]和成鱼[11]患腹水病，患病的大菱鲆腹部出血膨大，挤压有液体流出，解剖可见淡黄色液体等。姜燕等[27]从患肠炎病的大菱鲆中分离出了溶藻弧菌。对弧菌毒力的研究表明，AcfA是弧菌重要毒力蛋白之一，能有效促进致病菌与宿主的黏膜黏附。陈妍妍[34]通过对溶藻弧菌acfA基因缺失株的研究，证实溶藻弧菌的acfA参与调控该菌鞭毛组装、能量代谢等相关基因的表达，对sodB、flgG和dctQ具有正调控作用。

1.5 创伤弧菌

创伤弧菌普遍存在于河口、海水等环境中，是人类和养殖水产动物重要的病原菌之一，可引发原发性败血症，是目前发现的弧菌中致死率最高的致病菌，被称为“海洋中的无声杀手”[35-36]。创伤弧菌可引起人类的胃肠道疾病，严重者可引发败血症，50%以上患者因脏器功能衰竭而死亡[36]。沿海的国家基本上都对该菌有研究。据报道，美国因食用海鲜死亡的病例中，95%以上是由创伤弧菌引起的[37]。我国的江浙、闽粤沿海及台湾地区也有较多的感染情况发生[38-39]。创伤弧菌能引起大菱鲆患出血性败血症、腹水症[13]。感染早期，病鱼的出血现象不严重，不容易被发现，后期病鱼体表出现弥漫性出血点，毛细血管扩张充盈，并伴有腹水，解剖可见肠壁有出血点[13]。

目前对该菌致病因子的研究已达到全基因组层面，已有关于pldA、vgrG、aroQ、glpA等11个与创伤弧菌致病性相关的毒力基因的报道[40]，如pldA基因编码磷脂酶A1是创伤弧菌溶血和致死的主要因子，vgrG基因能编码六型分泌系统(type VI secretion system，T6SS)蛋白，通过肌动蛋白交联域(actin cross-linking domains)发挥作用，影响创伤弧菌毒力。其中张嘉鑫等[40]于2020年报道新发现了aroQ和glpA基因编码代谢蛋白，gspE、tolQ、flgJ、flgH和fliF基因编码结构蛋白，VVCECT4999-03045和tpbB基因编码信息传递蛋白。

1.6 灿烂弧菌

灿烂弧菌能感染多种水产养殖动物，如海参、贝类及鱼类等。国内外学者研究发现，灿烂弧菌能感染大菱鲆幼鱼，并导致幼鱼的高死亡率。黑瘦症是影响大菱鲆育苗成活率的重要因素之一。王印庚等[41]从患黑瘦症的养殖大菱鲆幼苗中分离到了灿烂弧菌，病鱼体色发黑，鱼体瘦弱，头大躯体小，呈蝌蚪状畸形，发育迟缓，变态率低，基本不摄食。该病发病快，死亡率高。解剖后进行组织病理分析，可见病鱼内脏组织器官萎缩、溃烂，肝组织萎缩变性，脑组织神经元细胞核溶解[41]。研究发现，灿烂弧菌是1种具有强黏附力的致病菌[42]，VsA蛋白与灿烂弧菌的生长、抗氧化有关，VsA基因是1种黏附因子，在黏附宿主细胞的过程中发挥作用[43]。

2 病原鉴定方法

快速诊断是疾病防治的重要手段，检测弧菌病有传统微生物学、分子生物学和免疫学等方面的方法。解剖患病的鱼，从组织分离纯化优势菌进行生理生化试验，通过《伯杰细菌鉴定手册》进行鉴定是比较传统的方法。在细菌鉴定中还常用16S rDNA序列分析、构建系统发育树的方法。近年来对于大菱鲆弧菌病原鉴定的检测技术又有多项突破。

创伤弧菌也是人类疾病的病原菌。关于该菌的研究较多，目前用于检验该菌的技术除常规分离鉴定法外，还有脂肪酸气相色谱分析法[44]、胶体金免疫层析法[45]、分子生物学法(如常规PCR[46]、多重PCR[47]、荧光定量PCR[48])和变性高效液相色谱技术[49]等。近几年，一些学者研究出了新的检测技术，为大菱鲆弧菌病的检验提供了更加高效快速的手段。如Yin等[50]建立了多重降落PCR方法，该方法对创伤弧菌的检测灵敏度为104CFU/mL，对溶藻弧菌和副溶血弧菌的检测灵敏度为103CFU/mL。凌莉等[51]基于gryB基因保守序列建立了重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌，其反应条件为：在37 ℃下恒温反应40 min即可，不需要特殊的仪器设备，灵敏度可达0.1 ng/μL，与PCR相当。张晶等[52]针对创伤弧菌vvhA基因序列保守区域设计了交叉引物恒温扩增技术，对创伤弧菌的检测灵敏度达1.28×103CFU/mL，检测时长为40～60 min。李伟等[53]以β-actin基因为内标基因、创伤弧菌gryB基因为目标基因建立的重组酶聚合酶扩增技术(RPA-IAC)，在37 ℃下恒温40 min即可出结果，检测灵敏度达0.1 ng/μL。

基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR可用于灿烂弧菌的检测，最低可检测到20个拷贝gyrB基因，而同等条件下普通PCR扩增反应中最低可检测出104个拷贝的灿烂弧菌gyrB基因[54]。另外，成翔宇等[55]通过对3个基因设计特异性引物建立的针对溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的多重PCR检测方法，灵敏度为102～103CFU/mL。绳秀珍等[56]构建了鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌等6种鱼类病原性弧菌的血清学诊断抗原芯片，为大菱鲆弧菌病的血清学诊断奠定了基础。

养殖动物患弧菌病的水体弧菌临界浓度为104个/mL[57]。因此，上述方法均可用于养殖生产中病原弧菌的检测。

3 养殖大菱鲆弧菌病的防治

3.1 预防方法

对于大菱鲆弧菌病的预防，除了提高养殖管理水平、加强营养控制、保持良好水质等生态防御手段外，还可以采取免疫预防的方法，如有针对性地投放免疫增强剂来提高大菱鲆对病害的抵抗能力。细菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)能针对特异性抗原起到保护作用，可以充当免疫促进剂。张伟等[58]的研究表明，溶藻弧菌脂多糖对大菱鲆的相对免疫保护率(RPS)可达75%。

为提高大菱鲆对弧菌病的免疫力，一些学者进行了大菱鲆几种常见弧菌病疫苗方面的研究，结果表明，采用弧菌疫苗来预防大菱鲆弧菌病具有很好的效果[59-67]。其中，曹宏梅等[61]用福尔马林灭活鳗弧菌和溶藻弧菌制备了2种单疫苗及二联疫苗，通过腹腔注射免疫大菱鲆后，二联疫苗对鳗弧菌和溶藻弧菌的RPS分别为83.52%和83.24%，鳗弧菌单苗对鳗弧菌攻毒的RPS为80.37%，溶藻弧菌单苗对溶藻弧菌攻毒的RPS为74.89%。张振国等[62]通过“挤出—滚圆”法制备了鱼用三联疫苗，经大菱鲆口服后，对溶藻弧菌和副溶血弧菌的RPS均超过50%。

丁山[63]制备的鳗弧菌三价灭活疫苗和鳗弧菌O1血清型灭活疫苗，经腹腔注射大菱鲆后28 d，RPS达到100%。鳗弧菌O1、O2、O3血清型灭活疫苗的免疫保护期达150 d以上，RPS最高达100%[64-66]。

另外，有学者研究发现，哈维氏弧菌TrxR蛋白具有较好的免疫原性，大菱鲆经其免疫后，对哈维氏弧菌的RPS为75%，表明其可作为亚单位疫苗用于该菌的免疫预防[67]。

3.2 治疗方法

研究发现，在大菱鲆弧菌病的治疗方面，一些西药、中药及生物抑菌剂等对大菱鲆弧菌病原具有很好的抑制效果。药敏试验显示，从山东省某地的大菱鲆中分离的弧菌对恩诺沙星、盐酸多西环素最为敏感，由弧菌引起的肠炎病可采用硫酸新霉素对症治疗[68]，用氟苯尼考防治大菱鲆弧菌病也是可行的[69]。一些学者通过研究中草药体外抗菌效果证实，苏木、五倍子、地锦草、石榴皮等4种中草药对鳗弧菌等4种病原弧菌的抑制和杀灭作用明显，最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)为1.56～3.12 mg/mL，最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)为3.12～6.25 mg/mL[70]；白头翁、五倍子、石榴皮等3种中草药对鳗弧菌的MIC为3.125 mg/mL，MBC为6.25 mg/mL[71]；鳗弧菌对菌陈、黄岑、乌梅等中草药高度敏感，五倍子对鳗弧菌的MIC为1.51 mg/mL，MBC为12.5 mg/mL[5]；五倍子和白头翁对灿烂弧菌的MBC均为25 mg/mL，黄柏、穿心莲对灿烂弧菌的MBC为50 mg/mL[41]。

有学者通过药敏试验证实，弧菌已对多种类抗生素产生了不同情况的耐药性[69,72]。弧菌病的治疗药物可根据情况选用相关部门批准的水产养殖用药，但需要注意部分药物的休药期问题。除此之外，用于替代抗生素的天然无公害生物抑菌剂的研究一直在进行，其中噬菌体疗法在水产养殖中应用广泛，具有无污染、不残留、不导致耐药等优点，可用于大菱鲆弧菌病的治疗。目前溶藻弧菌噬菌体对大菱鲆弧菌病的治疗能力得到了证实，应用噬菌体制剂试验组大菱鲆的生存率为70%[73]。植物精油具有抗菌活性，肉桂醛对大菱鲆弧菌的MIC为0.25 μL/mL，百里香酚为0.5 μL/mL，富含芳香醛、芳香酚和柠檬醛等成分的植物精油能够很好地抑制大菱鲆弧菌[74]。

4 结语

养殖大菱鲆弧菌病的多种病原菌，如哈维氏弧菌[24]、创伤弧菌[37]、溶藻弧菌[30]等不但能感染水产养殖动物，而且会对人类健康造成重大危害，是公众饮食健康的重大威胁之一。我国海产品种类丰富多样，每年都有因食用海产品而引起的急性胃肠炎、腹泻、食物中毒等疾病的报道，因此研究水产动物弧菌病的检测技术及防治方法具有重要意义。

传统检测方法结果准确，但是存在耗时长、操作繁琐且检测目标单一、效率低、灵敏度低等问题。另外，有些菌由于检测基因相似度高，采用16S rDNA序列分析法无法将其鉴定到种。目前大部分可以在遗传基因水平上检测弧菌的技术要求高、价格昂贵，很难在基层推广应用。因此，对适用于基层检测、设备要求不高、操作技术简单、检测时间短、检测灵敏度高的新型检测技术的研究十分必要。

长期使用抗生素治疗会使病原菌产生耐药性，并带来水产品药物残留等问题。2019年，国务院兽医行政管理部门公告水生食品动物禁止使用的药品及其他化合物，将79种药物划为禁用药物，其中包括头孢曲松、头孢哌酮、洛美沙星、氧氟沙星等几十种抗生素，这为今后水生动物病害防治带来了新挑战。因此，在大菱鲆弧菌病的防治中，从源头上防病显得尤为重要。养殖者可采用投喂免疫增强剂的方法来增强鱼类的免疫力，通过接种上市疫苗进行防病。但目前针对弧菌病疫苗制剂免疫效果的评价大多来自实验室，进入中试阶段的较少，如何获得生产批文并投入生产是关键。因此，养殖大菱鲆患病后，要及时准确地诊断病原，并选用已经批准使用的水产用兽药进行对症治疗。