罗非鱼罗湖病毒的诊断及其防控建议

秦真东，林 蠡

(仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225)

近年来随着罗非鱼养殖密度和规模的不断扩大，多种病害的频繁暴发给全球罗非鱼健康养殖产业造成严重威胁。值得注意的是，2009年以来，在以色列、厄瓜多尔和埃及等国相继暴发养殖和野生罗非鱼大量死亡事件，对全球罗非鱼养殖构成了严重威胁。直到2014年，Marina Eyngo等通过分离鉴定才发现其病原是新型RNA病毒，并将该病毒命名为罗湖病毒(Tilapia lake virus，TiLV)。目前，该病毒相关研究还十分缺乏，特别是在我国广泛养殖的罗非鱼中的感染情况还未见详细报道，也缺乏有关其综合防控策略。本文从罗非鱼感染罗湖病毒后的病理变化及其检测方法建立，结合目前的研究现状对罗非鱼罗湖病毒提出综合防控建议。

一、实验鱼感染

挑选健康的吉富罗非鱼(广东罗非鱼良种场)，体质量(30±5)克，随机分为两组，每组10尾。感染组每尾鱼腹腔注射200微升TiLV(病毒浓度1×106拷贝/毫升)，对照组注射等量灭菌的PBS。感染7天后，观察鱼体的临床病理变化情况，并采集脾脏用于后续检测。

二、临床变化情况

罗非鱼在罗湖病毒感染7天后发生显著的临床病理变化，如图1所示。与对照组相比，感染罗湖病毒后，鱼体活力明显下降，嗜睡、眼部病变充血浑浊、皮肤糜烂和体色发黑，鱼体黏液脱落明显，鳞片脱落严重，尾鳍部分残缺，身体表面出现明显的出血现象。解剖后发现，整个鳃丝严重出血，内脏组织出血严重，特别是肠道膨胀出血，肠壁变薄，没有明显腹水存在，肛门红肿不显著。罗非鱼感染罗湖病毒的大量死亡可能与呼吸功能衰竭以及内脏功能紊乱有一定关系，但是具体的原因还需要进一步深入研究。

三、罗湖病毒的检测

将采集的脾脏组织提取总RNA，根据HIScript®Q Select RT SuperMix(诺唯赞，南京)说明书进行cDNA合成。采用套式RT-PCR方法对罗湖病毒进行检测。

图1 罗非鱼感染罗湖病毒后的临床变化

第一步反应：在0.2毫升PCR薄壁管中，按每个样品20微升扩增体系配置，包括2×Taq Mix 10微升、10微摩/升上游引物(TiLV Nested ext-1)和下游引物(ME1)各1微升、双蒸水6微升、cDNA模板2微升。扩增程序为95℃3分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃0秒，共35个循环；72℃10分钟，1%的琼脂糖凝胶检测。结果显示，感染的两条罗非鱼均扩出1条450 bp的条带(图2)，而非感染罗非鱼没有检测到条带，通过在NCBI比对显示与TiLV比对率为99%。

第二步反应：在0.2毫升PCR薄壁管中，按每个样品20微升扩增体系配置，包括2×Taq Mix 10微升、10微摩/升上游引物(ME2)和下游引物(ME1)各1微升、双蒸水6微升、cDNA模板(稀释1 000倍)2微升。扩增程序为95℃3分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，共35个循环；72℃10分钟，1%的琼脂糖凝胶检测。结果显示，在感染的两条罗非鱼均扩出1条250 bp的条带(图2)，而非感染罗非鱼没有检测到条带，通过在NCBI比对显示与TiLV比对率为99%。

套式RT-PCR检测结果表明，本实验中的罗非鱼确实感染了罗湖病毒，并且能够特异性检测出罗湖病毒。

图2 TiLV套式PCR检测结果

四、防控建议

目前没有针对罗湖病毒的有效防治方法，因此只能通过建立综合防控策略，减少罗湖病毒对罗非鱼养殖产业造成的威胁。笔者对罗湖病毒的防控建议如下。

1.建立罗湖病毒流行病学调查

目前在埃及、厄瓜多尔、以色列等多地研究发现，罗非鱼大量死亡主要发生在天气炎热的5-10月，因此猜测罗湖病毒主要暴发于温度相对比较高的季节，而目前关于国内的流行情况仍然不清楚。因此，开展国内不同区域流行的情况对于防范罗湖病毒具有重要意义。流行病学调查的内容主要包括流行季节、水温情况、水质环境情况、水域环境等，其次罗非鱼的养殖密度、规模以及鱼体尺寸等情况也是十分重要的调查对象。目前研究发现该病毒可以通过一个养殖池扩散到另一个养殖池，并且不同生长期的罗非鱼也存在差异，因此开展罗湖病毒病流行病学调查对于防控罗湖病毒大规模暴发具有重要作用。

2.建立快速精准的检测方法

目前人们在病原检测方面已建立多种检测方法，但是对罗湖病毒的检测方法还十分缺乏。目前已经建立的方法有实时荧光反转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)、实时荧光定量RT-PCR、套式RT-PCR等，目前的检测方法主要是建立在核酸水平，因此仍需开发更快速、精准的检测方法。除了核酸检测方法外，仍需建立蛋白质水平上的检测方法，比如建立在特异性抗体上的ELISA检测法、免疫荧光法以及免疫胶体金等方法。同时，建立对罗湖病毒敏感的细胞系也是检测罗湖病毒重要的方法之一，可以更深入研究罗湖病毒的入侵机制。

3.加快技术攻关及有效药物的筛选

罗湖病毒的大量暴发对罗非鱼的健康养殖造成严重威胁，虽然目前在国内的暴发记录不多，但是仍然需要做好技术攻关以应对其大量暴发。需要弄清楚罗湖病毒的感染途径、复制方式以及致病机制。根据罗湖病毒的作用特征，开发应对的有效药物，比如开发有效的中草药，一方面可以增强鱼体免疫力，另一方面可以直接抑制罗湖病毒的感染。同时，可以筛选合适的饲料添加剂，比如多糖类药物等，提高鱼的免疫力，减少鱼的死亡率。

4.保持良好养殖水域环境

良好的养殖水域环境是缓解病害发生重要因素，如何保持良好的水质，显得十分重要。足够的溶氧，合适的养殖水温，定期检测氨氮、亚硝酸盐等水质指标，定期对水质进行改良，一方面可以提高养殖鱼的免疫力，另一方面也可以减少对鱼体的应激。同时，控制合适的养殖密度，投喂优质饲料以及合适的投食量也是保持水质良好重要的因素。总之，实时保持水质良好对于防控罗湖病毒的暴发也至关重要。

5.开发高效特异的疫苗

高效特异的疫苗仍然是防控病毒暴发的最有效途径。疫苗种类繁多，包括弱毒疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗等，各有特点，均可以在防控罗湖病毒中发挥重要作用。此外，开发高效特异性的卵黄抗体也是防控罗湖病毒的良好选择。总之，开发高效特异的疫苗是防控罗湖病毒众多防控手段中最直接、最有效的选择。

6.其他

防控罗湖病毒除了上述手段外，还需要做到精细化管理，开发更加优质的罗非鱼苗种，做好病毒溯源、亲鱼和苗种的监测等，通过多种防控方法，共同防控罗湖病毒。

五、总结

经过学者多年的不懈研究，目前已经初步建立了罗湖病毒的分离鉴定以及检测方法，相信随着研究的不断深入，将会出现更多快速精准的检测方法和防控手段，共同为罗非鱼养殖产业的健康发展保驾护航。