水产动物染色体操作育种研究进展

陈小慧，王 中，江会杰，韩奋杰，张伟杰

(农业农村部北方海水增养殖重点实验室 大连海洋大学，辽宁 大连 116023)

染色体操作是为了快速获得经济性状的遗传改良，通过人为手段改变有性生殖生物原有的染色体组的技术，主要包括人工诱导多倍体、雌核发育和雄核发育等。染色体操作育种作为细胞工程和现代遗传育种的重要组成部分，已成为提高水产动物育种效率的最有发展前景的生物技术之一。

近年来，随着人们对水产动物综合价值利用的重视程度的不断提高以及水产动物相关加工产品的社会需求量持续增长，传统的水产动物养殖品种和养殖技术已经不能满足水产品市场对产品产量和质量的要求。并且，目前大多水产苗种生产企业在育苗过程中疏于选择亲本，多代近亲繁殖导致的养殖群体种质资源退化现象十分严重。种质退化使水产动物抗病力下降、成熟个体小型化、品质下降、对环境的适应性和抗逆性降低，如目前养殖大黄鱼已经普遍出现了生长缓慢，经济性状变差，性成熟低龄化，品质下降等种质退化现象。种质退化会导致水产养殖经济效益的降低，制约水产养殖业的健康可持续发展。

为了提高养殖水产动物的生长速度、肉质、抗病和抗逆能力，国内外研究者致力于利用现代生物技术培育新品种,在水产动物的染色体研究及染色体操作育种方面取得了较多成效，从染色体水平为水产动物的综合利用提供了理论依据和实践指导。水产动物染色体操作育种的发展也大力推动了我国水产育种技术的进步。

1 人工诱导多倍体

1.1 人工诱导多倍体的方法

多倍体育种是通过增加染色体组的方法来改造生物的遗传基础，从而培育出符合要求的优良品种。相对于同种的二倍体，多倍体往往具有个体大、产量高、抗病力强等优点。多倍体诱导及其生产性能研究一直是水产养殖研究领域的热点之一[1]。目前，多倍体育种技术在鱼类、贝类、甲壳类等水产动物育种中已取得了一些成就。诱导水产动物多倍体产生的方法主要有物理方法(包括静水压诱导[2]、温度休克诱导法[3])、化学药物诱导方法(细胞松弛素B(CB)[3]、6-二甲基氨基嘌呤(6- DMAP)[4]、咖啡因[5]等诱导)和生物方法(远缘杂交[6])。

国内外已先后报道过利用温度休克的方法对黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[7]、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[8]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[9]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[10]，以及牙鲆(Paralichthysolivaceus)[11]、真鲷(Pagrosomusmajor)[12]诱导三倍体。Li等[13]、张晓军[14]和FastandWyban[15]利用温度休克方法分别诱导中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)、斑节对虾(PenaeusmonodonFabricius)和凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)多倍体。Chourrout[16]采用静水压法诱导出了虹鳟的三倍体。桂建芳等[17]诱导出水晶彩鲫三倍体胚胎。除此之外，也有报道大黄鱼(Larimichthyscrocea)[18]、牙鲆[19]、舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax)[20-21]、庸鲽(Hippoglossushippoglossus)[22]、银大马哈鱼、黄鲈(Diploprionbifasciatum)利用静水压方法诱导出三倍体胚胎[12]。静水压法较适用于卵径较大的水产生物，在贝类方面，静水压方法应用不多，仅在皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)[23]、悉尼岩牡蛎(Saccostreacommercialis)[24]、太平洋牡蛎(Crassostreagigas)[3]等贝类有所报道。

CB在鱼类及其他水产动物中应用较少，而在贝类和甲壳类水产动物雌核发育人工诱导中应用较为常见，目前已在长牡蛎(Crassostreagigas)[25]、僧帽牡蛎(Ostreacucullata)[26]、海湾扇贝(Argopectenirradians)[27]、华贵栉孔扇贝(Chlamysnobilis)[28]中有较高的诱导效果。近年来，在虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)、泥蚶(TegillarcagranosaLinnaeus)、缢蛏(Sinonovaculaconstricta)、皱纹盘鲍多倍体育种方面也有较新进展[1]。利用CB，包振民等[29]也诱导出中国明对虾三倍体，陈立侨[30]等诱导出中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)三倍体，相建海等[31]诱导出中国明对虾四倍体胚胎，崔朝霞[32]诱导出中华绒螯蟹的四倍体胚胎。6-DMAP在鱼类中应用较少，主要应用在贝类诱导多倍体中，在虾蟹和棘皮动物方面也有见报道。贝类中利用6-DMAP诱导虾夷扇贝[33]、太平洋牡蛎[4-34]、栉孔扇贝[26]、缢蛏[35]、泥蚶[36]等的三倍体。在虾蟹方面， Xiang等[37]、Coman等[38]、崔朝霞等[39]分别利用6-DMAP诱导出中国明对虾、日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)、中华绒螯蟹的三倍体。Sellars等[40]、崔朝霞等[32]分别诱导出日本囊对虾和中华绒螯蟹四倍体。

生物学方法是通过物种种间或者种内的杂交方法，进而获得多倍体的手段。此方法在鱼类中应用的比较多，如刘少军等[41]用不同倍性的团头鲂和黄尾密鲴进行远缘杂交，获得不同倍性的鲂鲴与鲴鲂，同样的方法应也用在红鲫与黄尾密鲴，红鲫与翘嘴红鲌中。但是在贝类、虾蟹类应用的较少，棘皮动物中未见报道。如图1所示，是荒井克俊[42]以贝类为例所总结出人工诱导多倍体的原理示意图。

目前研究有效诱导获得水产动物四倍体的技术，是染色体组操作研究的热点。以往研究表明，四倍体的诱导率很低，但是，如果能够获得少量的可育四倍体，再通过交配就可获得一个四倍体群体，尽管这种四倍体群体只具有很窄的遗传基础，仍可为生产三倍体提供物质基础。结合现代分子生物学和生物技术，染色体操作育种可以有更进一步的发展和应用。

图1 水产动物(贝类)人工诱导多倍体原理

1.2 检测多倍体的方法

1.2.1 染色体制备法 传统的染色体制备原理是使分裂的细胞停止在中期，破膜以后平铺在载玻片上，吉姆萨染色观察。首先在制备染色体的选材方面，鱼类[43-44]染色体制备所用的组织主要有鳃丝、肾、鳍条、血液、受精卵、胚胎等。贝类[45]一般选择胚胎制作染色体,但胚胎的获取受繁殖季节限制,成贝也用鳃细胞制作染色体[46]。虾类[47]、海胆类[48]以早期胚胎为染色体制备的首选材料。染色体制备的步骤首先是秋水仙素处理，让染色体停止在细胞分裂中期，然后用低浓度溶液低渗，一般选择KCl溶液，或者柠檬酸钠溶液，低渗的目的是为了让细胞膨大，染色体分开不相互重叠，然后用预冷的卡诺固定液固定以后-20 ℃冰箱过夜就可滴片。滴片后吉姆萨染液染色，直接镜下观察。图2所示是李霞等[49]通过该实验方法获得二倍体泥鳅细胞的染色体及核型。通过染色体制备来确定水产动物的倍性更直接，准确、有说服力，但是相应的制作过程比较麻烦，并且如何快速、简便地获得形态好，分裂指数高的染色体，也需要一定的实验技术支持。

图2 二倍体泥鳅染色体及核型分析

1.2.2 流式细胞术检测法 流式细胞术是一项现代化DNA倍性分析的高新技术，通过对细胞的光散射和不同荧光的多参数同步测定，可对单细胞的生物DNA倍性进行快速、精确的定性和定量分析。流式细胞仪主要由液流系统、光学检测系统和信号处理系统组成。DNA倍性分析的基本原理是将经特异性荧光染料染色的待测样品制成单细胞悬液，在气压推动下进入流动室，通过激发光源照射可激发经荧光染色DNA分子促发荧光，测定荧光强度，与测定装置相连的计算机分析软件可对荧光强度进行分析。通过流式细胞分析仪对大量的处于分裂间期的细胞 DNA含量进行检测，然后经与仪器连接的计算机自动统计分析，最后绘制出 DNA含量 (倍性)的分布曲线图[50]。在实际测量水产动物倍性的时候，选择一个已知倍性的同类材料作为参考，将峰的位置设定在相应位置，然后将待测样品峰出现的位置与其比较，就能准确知道待测样品的DNA含量，然后就能快速得到待测样品的倍性。图3所示是陈春山等[51]通过Pactec CyFlow Cube 8 型流式细胞仪检测鱼苗血液DNA相对含量的方法确定三倍体倍化率示意图。

如今，由于流式细胞术测定细胞核DNA含量的精确度高，通过比较细胞核 DNA含量来鉴定倍性的可靠性比间接鉴定更为准确，并且测量一个样只需要短短几分钟的时间，因此越来越多的科研人员选择在倍性检测中使用流式细胞术。

图3 二倍体和三倍体细鳞鲑相对含量

2 雌核发育

雌核发育技术一般是指采用物理、化学方法灭活精子，灭活后的精子与正常的卵子授精，精子起到刺激作用，精核不与卵核融合形成合子，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行的一种发育方式。

雌核发育在鱼类育种中已经取得了很大的成就，由于不少鱼类在生长和个体大小等重要经济性状上表现出显著的性别异形，例如鲤鱼[52]、牙鲆[53]、虹鳟[54]、大西洋鲑[55]、半滑舌鳎[56]、金钱鱼[57]等都是雌性个体较大的养殖鱼类。王延晖等[58]也证明了雌性黄河鲤鱼较雄性黄河鲤鱼生长速度快，个体大，并且正常黄河鲤鱼在自然生长过程中的繁殖会消耗大量能量，影响生长，因此开展雌核发育实验培养全雌群体对黄河鲤鱼的生产有积极的影响。因为有显著经济性状的优势，相比虾蟹，贝类、棘皮动物、鱼类育种研究中要更加深入，并且很多鱼类雌核发育的品种已经做到了产业化，投入到了生产之中。比如牙鲆、方正银鲫已经成为雌核发育技术应用于产业的代表性鱼类。人工雌核发育草鱼制成的杂交抗病苗种已投入商品生产阶段，生产出的苗种抗病力强，产生了巨大的经济效益。而在贝类、棘皮动物中，齐明君等[59]报道过紫贻贝雌核发育二倍体的相关研究,商文聪等[60]通过电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育，并得到了单倍体胚胎。丁君等[61]初步研究过中间球海胆雌核发育单倍体胚胎，曹学彬等[62]研究过马粪海胆雌核发育的早期胚胎，聂鸿涛等[63]对刺参雌核发育二倍体进行过相关报道。图4是范兆延[64]总结出雌核发育二倍体人工诱导原理示意图。

图4 雌核发育二倍体人工诱导的原理

3 雄核发育

雄核发育是指遗传失活的卵子与精子受精,产生的后代仅含有父本遗传物质个体的繁殖方式。雄核发育可以通过人工诱导实现，方法通常使用紫外线、X射线、γ射线等物理方法处理的卵子，使其失活后参与受精，再在适当时间通过冷、热、高压等处理使精核的染色体加倍，进而发育成为完全是父本性状的二倍体。

与人工诱导的雌核发育相比，人工诱导的雄核发育个体生存率更低，雄核发育在植物育种中应用较多，水产动物中仅在鱼类有些研究。早在1996年，Corley-Smith等已经通过热休克处理的方法获得了斑马鱼雄核发育二倍体。近年来周贺等[65]、Morishima et al.[66]、王玉生等[67]、林忠乔等[68]利用温度休克的方法分别得到红鳍东方鲀雄核发育单倍体、泥鳅的雄核发育后代、大鳞副泥鳅雄核发育单倍体、泥鳅雄核发育二倍体。关于贝类雄核发育的研究在国内外都很少，仅在虾夷扇贝[69]、栉孔扇贝[70]、太平洋牡蛎[71]等物种中有研究，在棘皮动物中未见报道。

4 总结与展望

随着水产动物种质退化的现象加剧，优质新品种的培育需求极为迫切。多倍体所具有的优良品质符合当下及未来水产养殖的需求，而通过染色体操作获得多倍体是目前获得多倍体最有效的方法，所以未来的水产养殖技术可能会以染色体操作作为常规育种手段，从而获得更高的经济效益。当下的染色体操作还未完全成熟，有很多未探索的区域，多种经济水产动物的多倍体还未培育成功，若将水产动物染色体操作育种技术发展成熟，将会大大提高我国水产养殖业的经济效益。