精液超低温冷冻保存技术的研究始于２０世纪５０年代，此项技术发展至今已取得很大成就［１］。目前，鲟类精液超低温冷冻保存虽然已取得了显著的成果，国内外有一些成功的报道，部分种类可以应用于实验室中冷冻库的建立，以及在种质资源保存上发挥重要作用，但大多数鲟类的精子解冻后只获得有限的孵化率，这种状况影响了此项技术在生产上的推广应用［２－３］。史氏 鲟 （Ａｃｉｐｅｎｓｅｒ　ｓｃｈｒｅｎｃｋｉｉ）属 鲟 形 目、鲟属，原产于黑龙江流域，为主要的淡水养殖品种之一［４］。为了解决鲟鱼人工繁殖中雌雄性腺发育不同步及雄鱼不足的问题，笔者于２０１０年４月以史氏鲟精子为材料进行了超低温冷冻保存和冻精人工授精试验，旨在验证经过冷冻保存史氏鲟精子的授精能力，摸索出一套有效的鲟鱼精子超低温冷冻保存方法和冻精授精技术，为濒危、珍稀鲟鱼种质资源保存及生物多样性的保护应用提供参考与借鉴。

１　材料与方法

１．１　材料

史氏鲟精卵均来源于从黑龙江引进、中华鲟研究所人工培育达性成熟的亲本，采用促黄体释放激素类似物（ＬＲＨ－Ａ２）对成熟的雄鱼和雌鱼进行注射催情，采取挤压法采集精子和卵子。显微镜下观察精子激活率＞（７５．０±４．５）％，ｐＨ计（上海康仪仪器有限公司生产）经校正后测定史氏鲟精液ｐＨ值为８．０４。将采集到的干净无水精液按６０～８０ｍＬ的量分装保鲜袋充氧，置于２～４℃培养箱冷藏，经超低温冷冻直接投入液氮中保存，５ｈ后冻精解冻与产出的史氏鲟成熟卵进行人工授精。试验所用精卵分别来自同一组雄雌鱼。

１．２　方法

１．２．１　冷冻精子稀释液及激活液

参照文献［２］二步降温法筛选步骤及前期开展的鲟鱼精子超低温冷冻保存试验数据，选取浓度为：Ｔｒｉｓ　２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ　０．５～２ｍｍｏｌ／Ｌ和Ｓｕ－ｃｒｏｓｅ　３０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ配制浓度梯度稀释液，加入终体积分数为８％的甲醇作为抗冻剂，对稀释液进行预筛选，得出３个保存效果较好的稀释液配方（表１）用于精子超低冷冻保存和人工授精试验。激活液（Ｄ）配方为：Ｔｒｉｓ　１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＮａＣｌ　１０ｍｍｏｌ／Ｌ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｇｌｕ，ｐＨ　８．０。

１．２．２　精子冷冻及解冻

取活力大于７０％的鲜精，按１∶２分别与２～４℃的各个配方的抗冻稀释液混合，分装２ｍＬ冻存管，采用二步降温法，即距液氮面上２～３ｃｍ处平衡１０ｍｉｎ后，直接投入液氮中冷冻保存，３８℃水浴２ｍｉｎ解冻。

１．２．３　精子活力评价方法

用一次性注射器针头蘸取等量精液与在载玻片上的井水混合，用针头搅散，立即在显微镜下观察精子的运动情况，以视野内活动精子占精子总数的百分比［５－７］，即精子用激活率（％）来评价精子活力。活力检测由同一个人完成，每样重复３次。

１．２．４　冻精人工授精

雌鲟催情达效应时间，轻压腹部能挤出卵或产卵时开始解冻冷冻精子，同时采卵。每样每１０ｍＬ卵子加入３ｍＬ解冻精子快速混合，随即加入激活液或井水５ｍＬ，柔和搅拌２０ｓ后，加入井水５ｍＬ搅拌１ｍｉｎ，用井水冲洗２次，放入加有２０％～２５％滑石粉孵化筛，静水增氧脱粘７０ｍｉｎ，流水孵化。以鲜精人工授精作对照组。孵化水温１５．７～１９．９℃，溶解氧７．０～７．６ｍｇ／Ｌ。胚胎发育至原肠期后统计受精率（受精率＝原肠期胚胎数／卵粒总数×１００％）和仔鱼出膜后统计孵化率（孵化率＝孵出仔苗数／卵粒总数×１００％）。

１．３　统计分析

试验数据采用ＳＰＳＳ　１１．０进行分析。

２　结果与分析

２．１　解冻精子的激活情况

３种稀释液保存的精子，解冻后镜检激活率分别为（３８．２±１．５）％、（３５．８±３．２）％、（５２．３±３．５）％（见表２）。配方Ⅰ和Ⅱ之间差异不显著（Ｐ＞０．０５），而配方Ⅰ、Ⅱ与 配方Ⅲ差 异显著 （Ｐ＜０．０５）。冻精与鲜精相比活力明显下降。

２．２　解冻精子的受精率

解冻精子采用激活液和井水为介质与卵受精，受精率见表２。由表２可见，配方Ⅰ、Ⅱ井水受精率要稍高于激活液，配方Ⅲ激活液受精率要高于井水，但差异均不显著。冻精试验组配方Ⅲ获得最佳受精率，但与对照组差异显著。

２．３　冻精受精卵的孵化率

对照组孵化率最高。冻精试验组卵受精的孵化率，配方Ⅰ、Ⅱ与受精率呈现相同规律，配方Ⅲ则激活液要高于井水（见表２）。

３　讨论

３．１　Ｋ＋对冻精活力的影响

有研究认为鲟鱼精子在形态、生理、生化上与淡水硬骨鱼类有很大不同，鲟鱼精子对Ｋ＋最敏感［２］。本次试验结果显示配方Ⅰ与配方Ⅱ的区别在于Ｋ＋浓度。从受精率和孵化率比较，在保存效果好的稀释液中，１～２ｍｍｏｌ／Ｌ，低浓度Ｋ＋比高浓度Ｋ＋对鲟鱼精子保存有利。

３．２　渗透压对冻精活力的影响

大多 数 硬 骨 鱼 类 精 液 渗 透 压 为２５０～３００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ，鲟 鱼 类 偏 低，史 氏 鲟 为３５ ～ ４５ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ，而 甲 醇 对 稀 释 液 的 渗 透 压 影 响 不大［３］。本次试验中配方Ⅰ、Ⅱ的渗透压相对于史氏鲟精液渗透压较接近，而配方Ⅲ相对偏高，获得了最佳激活率。一般认为，高渗溶液能够有效脱去精子内的水分，以免在快速降温过程中形成结晶导致精子破裂，从而利于精子的保存。本次试验结果表明，渗透压为５２～８２ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ，高渗稀释液有利于史氏鲟精子的保存。

３．３　激活—授精对受精率和孵化率的影响

配方Ⅰ、Ⅱ井水受精率要稍高于激活液，配方Ⅲ激活液受精率要高于井水，但差异均不显著。冻精试验组配方Ⅲ获得最佳受精率。结果表明：精子活力与精子受精率成显著正相关［３，６］。即解冻精子活力高，其受精率高。冻精试验组卵受精的孵化率，配方Ⅰ、Ⅱ与受精率呈现相同规律，配方Ⅲ则激活液高于井水，结果显示：解冻精子的受精率高并不一定意味着孵化率高。这可能是因为除精子在冷冻保存过程中引起精子结构和功能的不同程度损伤外［８］，抗冻稀释液的作用及冷冻解冻的处理，使精子本身的渗透压也发生了变化，在激活授精过程中，随着渗透压差的调节，精子吸水膨胀或脱水，致使精子在冷冻保存后虽然还保留着较好的授精能力，但部分受精卵不能发育成正常的胚胎。所以在科研生产应用中除了优化改进精子冷保存技术，降低精子冷冻损伤外，其中解冻精子的激活授精方法是影响冻精受精率和孵化率的关键因素之一。