杨 敏，周梦灵，郗宏焱，刘诗宇，文 鑫

(海南大学海洋学院，海南省水产种业工程研究中心，海洋生物国家级实验教学示范中心，南海海洋资源利用国家重点实验室，海南省热带水生生物技术重点实验室，海南 海口 570228)

生物的体色是生物长期进化以适应环境的重要手段，对生物的生存具有重要的意义，鱼的体色是区别它们的重要表型特征之一。目前已知的石斑鱼种类繁多，丰富的体色差异使其可作为研究鱼体色生态适应性的良好材料。虎龙杂交斑是以经2代群体选育的棕点石斑鱼雌体为母本、鞍带石斑鱼雄体为父本，杂交获得的F1代，具有育苗成活率高、生长速度快等优势。虎龙杂交斑在养殖过程中出现了较为丰富的体色类型，具体表现为白化、黄化等体色变化差异。本文以4种体色的虎龙杂交斑为研究对象，对其肝脏、前肾、脾脏组织中的丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽S转移酶(GSHST)活力、甘油三酯(TG)含量进行检测，比较其中与免疫相关基因的表达，以探究它们的生理状态。同时，采用蛋白质免疫印记试验分析4种体色虎龙杂交斑肝脏组织中MAPK 的激活水平。在此基础上，进一步检测其下游转录因子，以揭示MAPK信号转导通路调控不同体色虎龙杂交斑生理状态的潜在机制，初步探讨不同体色虎龙杂交斑生理状态的差异，为其健康养殖提供理论依据。

一、材料与方法

1.实验材料

本实验所用的虎龙杂交斑由海南省三亚市晨海水产有限公司提供。实验选择了相同养殖条件下的4 种不同体色，分别是正常体色(黑色，N)、白色(W)、黄色(Y)和黄黑间色(Sc)，如图1 所示，每种颜色各9 尾个体，平均长度为(32±5)厘米，平均体重为(520.3±20.5)克。用MS-222对实验鱼进行麻醉后解剖采样，取肝脏(L)、前肾(P)、脾脏组织(SP)样品保存于-80℃的条件下，用于后续的酶活检测、蛋白印迹分析、实时荧光定量分析等。

图1 4种体色的虎龙杂交斑

2.酶活检测

取4种体色虎龙杂交斑的肝脏、前肾、脾脏组织，准确称取样品重量，按重量(克)∶体积(毫升)＝1∶9 的比例加入9 倍体积的生理盐水作为匀浆介质，在冰水浴条件下进行机械匀浆，以2 500 转/分离心10 分钟，取上清液用以蛋白质浓度和酶活检测。谷胱甘肽S 转移酶(GSH-ST)活性、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)含量检测采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定。

3.蛋白质印迹法(免疫印迹实验)

利用全蛋白提取试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)提取4 种体色虎龙杂交斑的肝脏组织总蛋白，与上清液以4∶1 比例混合，100℃变性10 分钟，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。将PVDF 膜与TBST 和5%脱脂牛奶在室温下孵育2 小时，阻断非特异性结合。PVDF膜在4℃以下一抗孵育过夜。用TBST 洗膜液洗涤PVDF 膜，并进行二抗孵育，然后进行增强化学发光(ECL)和放射自显影。使用Amersham 成像仪600 系统(GE 医疗保健生物科学公司)对免疫印迹进行化学发光检测。

4.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

使用Trizol(Invitronen，15596-025)从4 种体色虎龙杂交斑的肝脏、前肾、脾脏组织中提取总RNA，实验采用了变性琼脂糖凝胶电泳和分光光度计NanoDrop2000 对RNA 样品的质量进行了检测。每个样本共1 微克RNA 用于RNA 样本的制备。以其中的mRNA为模板，使用HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme，R123-01)，进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR，rtpcr)获得cDNA，保存于-80℃条件下，用于后续的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。选取与虎龙杂交斑免疫相关的基因以及MAPK 通路下游转录因子(C-Myc、c-fos、p53、jun-D、igf、ednrb)，通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测相对表达量，用于反映虎龙杂交斑在分子水平上的生理状态差异，检测指标来源于先前的研究基础。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)使用2×Q3 SYBR qPCR Master Mix(Universal)(上海吐露港生物科技有限公司)进行，以β-actin 作为对照管家基因，每个实验重复进行3 次，最终反应体积为20 微升。用阈值周期值(Ct)法测定基因的表达水平，利用β-actin测定各基因的相对表达水平。使用Primer 5.0 设计的qRT-PCR引物信息如表1所示。

表1 引物信息

5.统计分析

数据采用单因素试验统计分析和LSD法进行分析。显著性水平设置为P＜0.05，试验结果以“平均值±标准差”表示。

二、结果与分析

1.酶活性检测

(1)甘油三酯(TG)活性。比较不同组间的显著性变化差异，结果显示TG 在黄色组肝脏中的含量高，活性显著高于其他剩余体色组，其他剩余体色组之间TG 活性没有显著性差异。TG 在4 个不同体色组前肾中的活性显示，正常体色和白色体色组显著高于黄黑间色和黄色组，其中正常体色组和白色体色组之间无显著性差异，黄黑间色组和黄色组之间没有显著性差异。在4个不同体色组脾脏组织中的活性显示，正常体色组显著高于其他体色变异组。

(2)丙二醛(MDA)活性。对于4个不同体色组的肝脏组织中的活性，比较不同组间的显著性变化差异，结果显示丙二醛(MDA)在黄色组中的含量高，活性显著高于其他剩余体色组，黄黑间色组显著低于黄色体色组但显著高于正常体色和白色体色组，正常体色和白色体色组之间没有显著性差异。MDA 在4 个不同体色组的前肾中的活性显示，黄黑间色体色组显著高于白色体色和黄色体色组。MDA 在4 个不同体色组的脾脏中的活性显示，黄色体色组显著高于其他剩余体色组，正常体色组显著低于其他变异体色组，MDA活性在白色与黄黑间色体色组之间没有显著性差异。

(3)谷胱甘肽S 转移酶(GSH-ST)活性。对于4个不同体色组的肝脏组织中的活性，比较不同组间的显著性变化差异显示，GSH-ST 在黄色体色组中的活性显著高于正常体色组、白色体色组、黄黑间色体色组，白色体色组的活性显著低于其他体色组，其中正常体色和黄黑间色体色组之间GSH-ST 活性没有显著性差异。正常体色组前肾中的GSH-ST 活性显著高于白色体色组、黄黑间色体色组、黄色体色组，黄黑间色体色组显著高于黄色体色组。GSH-ST 在正常体色组脾脏中的活性显著低于其他变异体色组。

2.参与MAPK通路的蛋白质表达水平

通过蛋白质免疫印记试验，在4个不同体色组的肝组织中均检测到MAPK 通路在蛋白质水平上的表达。在变异体色组个体中检测到的p38MAPK 和ERK1/2、磷酸化水平均显著高于正常体色组。白色体色和黄色体色组的JNK1 的磷酸化水平显著高于正常体色组，表明该通路的激活水平与体色变化存在一定的联系。

3.参与免疫调控基因的表达比较

实时荧光定量PCR 对参与免疫调控的基因在4 个不同体色组的3 个组织中的相对表达量检测结果显示，在肝脏组织中，c-fos、jun-D、p53、ednrb 4 种基因在黄色体色组中的表达量最高；C-Myc、igf 在黄黑间色体色组中的表达量最高；c-fos、C-Myc、jun-D、p53、ednrb、igf 6 种基因在白色体色组中的表达量最低。在前肾组织中，c-fos、C-Myc、jun-D、ednrb、igf在黄色体色组中表达量最高；p53在白色体色组中表达量显著升高。在脾脏组织中，c-fos在白色体色组中的表达量显著升高，在黄黑间色和黄色体色组中无显著性差异；C-Myc在黄色体色组中的相对表达量显著升高，在白色和黄黑间色体色组中无显著性差异。jun-D 在白色体色组中的表达量无显著升高，在黄黑间色和黄色体色组中的表达量显著性降低。p53 在黄黑间色体色组中的表达量稍有降低。ednrb、igf 两种基因在白色体色组中的相对表达量显著升高，但在黄黑间色和白色体色组中无显著性差异。

综上，黄色体色组虎龙杂交斑与正常体色组相比，肝脏中的GSH-ST、MDA、TG 含量相对较高，MAPK 通路的ERK1/2、JNK1 和p38MAPK 激活水平较高，下游转录因子表达量较高，在免疫组织中检测到了显著上调的igf、ednrb 基因。黄黑间色体色组和白色体色组与正常体色组相比部分免疫指标也呈现出了显著的变化。因此，4种不同体色虎龙杂交斑的生理状态存在一定的差异。这些差异的产生可能是由于不同体色的虎龙杂交斑抗氧化应激能力存在差异，在环境发生改变时，该差异在不同程度上影响了谷胱甘肽S转移酶(GSH-ST)活力、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)含量、MAPK通路激活水平及其下游转录因子和相关免疫基因的表达量，这些免疫指标的变化参与到机体的调控中，最后表现在生理状态的差异上。目前对于导致不同体色虎龙杂交斑出现不同生理状态的机制还需进一步探究。