锦鲤雌核发育繁殖技术

郦森庆，刘 峰，俞国钧，阮秋梅，姚金荣

(1.绍兴市上虞区水产技术推广中心，浙江 绍兴 312300；2.浙江省农业科学院水产研究所，浙江 杭州 310000；3.绍兴御锦生态农业开发有限公司，浙江 绍兴 312300)

随着经济社会的发展、人们生活水平的提高，消费者对具有观赏性和美好寓意的锦鲤需求量不断增加。然而，锦鲤在养殖过程中需要不断地筛选才能获得具有高观赏价值的锦鲤成品，最终的养殖成品率往往较低。养殖企业迫切需要通过技术手段生产具有高观赏价值的锦鲤品系，以提高养殖经济效益。实际生产中发现，雌性锦鲤较雄性锦鲤具有更宽的背部和更丰满的体形，具有更高的观赏价值。为此，2021 年绍兴市上虞区水产技术推广中心与浙江省农业科学院水产研究所合作，在绍兴御锦生态农业开发有限公司开展了锦鲤全雌品系生产试验，初步获得成功，共获得雌核发育后代鱼苗1 000尾，为锦鲤全雌繁殖奠定了种质资源基础。现将有关情况总结如下。

一、亲鱼选择

1.锦鲤亲鱼选择和培育 试验选留了品系纯正优良、特征明显、身体健壮灵活、游姿优美、全身光洁无病害的红白、大正、昭和3 个品系鱼196尾作为亲鱼，包括雌鱼56尾、雄鱼140尾(5～7 龄)，暂养于亲鱼培育池。繁殖前45 天在常规投喂配合饲料的同时增加投喂面包虫，进行营养强化；1个月后停喂面包虫，同时将人工配合饲料减半，控制投饲，以促进性腺发育和保持较好的肥满度。5 月24 日从日本进口亲鱼20 尾，暂养于圆形帆布桶中，作为后备亲鱼。

2. 团头鲂雄鱼收集和暂养 团头鲂雄鱼60 尾，规格2.0～2.5 千克/尾。5 月5 日购自松江区水产良种场，用活水车运至绍兴御锦生态农业开发有限公司，经人工配制的3%盐水浸泡消毒后，暂养于室内3米3的塑料桶中备用。

二、人工催产

1.催产剂种类

促黄体素释放激素类似物(LRH-A2)、多情素(HCG)、地欧酮(DOM)配合使用。

2.催产剂量

锦鲤雌鱼剂量为HCG 800单位/千克＋DOM 2毫克/千克＋LRH-A25微克/千克，锦鲤雄鱼减半。团头鲂雄鱼剂量为HCG 400 单位/千克＋DOM 1 毫克/千克＋LRH-A22.5微克/千克。

3.注射方法

采用胸鳍基部注射法，催产剂现配现用，待催产亲鱼经称重后分批催产，锦鲤和团头鲂催产同步进行。产卵池配备净水设备和增氧设备，并预先放置了消毒过的配套网箱，内置塑制毛刷和薄膜作产卵鱼巢，待产过程中始终充气增氧且循环流水。经检查，锦鲤雄鱼和团头鲂雄鱼精液质量好。

三、精液收集与精子灭活

根据亲鱼催产效应时间，观察到锦鲤亲鱼发情、自然交配产卵开始时，及时收取团头鲂精液，以备后用。精液收取方法：一人用湿毛巾包裹团头鲂鱼体并固定，将鱼的腹部朝上平放，另一人用柔软干净的毛巾擦干鱼腹，轻按腹部，白色精液随之流出，用吸管或针管吸取精液放入贮精瓶，再放入冰箱冷藏保存待用。精子采用紫外灭活仪进行灭活。

四、卵子采集

锦鲤亲鱼成熟度较好，催产后效应时间在12 小时左右，随时观察。当发现鱼开始追尾、卵巢及网箱上附有少量卵时，及时捞出雌鱼进行人工挤卵。方法是：用鱼夹固定雌鱼，一手指堵住泄殖孔，再用柔软干净的毛巾擦干鱼腹；雌鱼的腹部朝下呈45 度角，放开手指，轻轻挤压腹部，让卵子自动落入事先准备好的干净玻璃皿中，避光于冰箱低温保存，待诱导雌核发育。5 月6 日开始至6月18日结束，试验共采集卵子6批次。

五、冷休克诱导雌核发育

1.诱导染色体加倍

将灭活的团头鲂精子加入锦鲤卵子中，用鹅毛沿同一方向搅拌均匀，混合后的卵子均匀撒在水中鱼巢上，上巢、激活连续进行。撒卵过程中注意布卵密度，不要重叠。静置2分钟，待卵子粘牢后将卵巢移入温度控制仪进行冷休克处理。诱导雌核发育后的卵子放入露天的帆布孵化桶中孵化。

2.各项参数优化试验

基于锦鲤雌核发育首次试验，借鉴了其他鱼类雌核发育的冷休克方法，选择了不同档的冷休克温度和处理时间等参数，以所得雌核发育鱼苗量为标准，比较不同冷休克参数的试验效果。

六、试验结果

1.雌核诱导发育

试验共获得雌核发育后代鱼苗1 000 尾，雌核诱导孵化率平均为0.067%。

2.冷休克方案筛选

试验结果显示，3℃冷休克处理获得雌核发育鱼苗数量稍少于4℃处理结果，两者显著多于5℃处理结果。试验结果表明，最佳冷休克实施方案为精子灭活时间14～17 分钟，受精2～2.5 分钟，冷休克温度4℃，冷休克处理时间20～25分钟。

3.群体遗传多样性检测

试验结果表明，平均观测杂合度(Ho)为0.516，平均期望杂合度(He)为0.582，平均多态信息含量(PIC)为0.541(＞0.5)。从多态位和平均杂合度等遗传参数的数值来看，该群体在36 个微卫星位点的观测杂合度水平均较高，说明养殖的日本锦鲤具有很高的遗传多样性，这跟每年补充新的种质资源密切相关，有效避免了累代近交导致的种质衰退。

4.雌核发育苗种倍性检测

雌核发育锦鲤DNA 平均含量与锦鲤DNA 平均含量的比值为0.98，与团头鲂DNA平均含量的比值为1.43，由此得出，雌核发育锦鲤的倍性与母本锦鲤保持一致。

七、分析与讨论

1.人工雌核发育能快速产生近交系

经过一代人工雌核发育，子代近交系数平均约可达到0.6，相当于连续4 代近交。人工雌核发育结合性别人工控制后，理论上可在两个世代时间内获得所有基因座位完全纯合的纯系，纯系亲本可以稳定杂种优势。对于一些具有较快生长速度及较高商业价值的雌性种类，则可通过人工雌核发育与人工性别控制相结合的方法，大量繁殖全雌型后代。对于生产更具观赏性和经济价值的雌性锦鲤而言，雌核发育技术具有很大的优越性和较高的实际应用价值。

2.雌核发育卵孵化率较低的原因

本试验雌核诱导孵化率较低，对于养殖生产要求并不理想。究其原因，笔者认为：一是冷刺激设备与生产量不匹配。项目组是第一次进行生产性锦鲤雌核发育技术研究，应用了实验室的冷刺激设备，其容积较小，冷刺激温度较难控制，影响了雌核诱导发育。二是雌核发育卵在露天孵化，没有控制好孵化水温，孵化时间较长，发生了水霉病，导致卵子大量死亡，其中二批次卵全部死亡。因此，在今后的研究中，项目组将积极创造条件，优化技术，努力提高雌核诱导孵化率。

锦鲤的全雌品系生产技术包括雌核发育诱导技术和伪雄诱导技术。制备锦鲤的雌核发育系是基础，在此基础上培育伪雄系。伪雄系与雌性锦鲤交配，完成锦鲤全雌品系生产，以实现高附加值锦鲤全雌养殖。