一种小球藻室外塘口规模化培养方法

胡佳雯，聂志娟，孙 毅，陈春光，徐 跑，徐钢春

(1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏 无锡 214081；2.江苏恒泰环保科技发展有限公司，江苏 无锡 214124)

小球藻是一种普生性单细胞真核微藻，生长繁殖迅速、光合效率高，单位面积光合作用产出率为高等植物的10 倍以上，被誉为“罐装的太阳”。小球藻体内富含高达总体重58%的蛋白质、不饱和脂肪酸及维生素等(黄燕娟等，2013)，营养丰富、适口性好、无残饵污染，是高效、天然、健康的鱼、虾、蟹、贝类幼体优质的开口饵料，也是滤食性鱼和杂食性鱼成体的食物源。通过光合作用，小球藻不仅产生氧气供养殖生物利用，还可以高效吸收养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐等对水产动物有毒有害的物质，净化养殖水体(刘梅等，2015)。

本实验在室外塘口边采用池塘水进行小球藻培养，探究室外环境下最适的培养条件，建立一种塘口配套小球藻快捷、高效的培养方式，降低成本，提高便利性，推进水产养殖健康发展。

一、材料与方法

1.材料

实验藻种选自课题组纯化分离的淡水小球藻。实验用具为容积100 升白色塑料桶、300 目筛绢网、搅拌器、水泵、显微镜、鲁哥试剂。小球藻培养基配方为无菌有机肥5 克/升、维生素C 5.8 毫克/升、硫酸镁60 毫克/升、柠檬酸6 毫克/升、氯化钙30 毫克/升、磷酸氢二钾40 毫克/升、硫酸锌0.2 毫克/升、氯化锰1.8 毫克/升、碳酸钠20 毫克/升、纳米纤维素15 毫克/升、沼泽红假单胞菌1×106CFU/毫升。培养水源为室外养殖池塘水。

2.方法

(1)室外塘口培养。水泵抽取养殖池塘水后经300目筛绢网过滤至干净的培养桶内，每升培养水体加10 毫升培养基；调节藻种与池水的温度至温差不超过5℃后按比例接种，搅拌均匀后阳光下静置培养。每天监测水温、气温、光照。

(2)水质检测。检测培养用水中溶氧、总磷、总氮、亚硝酸盐、氨氮、化学需氧量(COD)、pH。其中溶氧、pH 及总磷、总氮分别采用哈希便携式溶氧仪、便携式pH 计以及总磷、总氮在线分析仪(型号LB-1000TN)检测。

(3)不同小球藻接种量对培养效果的影响。实验设置V(藻种)∶V(培养水体)为1∶2、1∶5、1∶10共3组接种比例，每组设3个重复，共设9组培养实验组，每组培养水体为100 升。接种结束后，每隔24 小时采集500 毫升培养液，进行培养液中小球藻细胞的密度显微计数观察，实验周期5天。

(4)培养后期不同处理方式对小球藻培养效果的影响。按V(藻种)∶V(培养水体)为1∶5 接种比例接种9组100升的培养实验组，相同条件下培养5 天后，藻液浓度进入平稳期，将其中3 组补加与初始等量的培养基、3组补加与初始双倍量的培养基、3 组不添加。接种结束后，每隔24 小时采集500毫升培养液，进行培养液中小球藻细胞的密度显微计数观察，实验周期10天。

(5)浮游植物的显微计数。在培养结束后取样500毫升，采用鲁哥试剂固定浮游植物。静置48小时后浓缩至50 毫升，然后吸取100 微升于浮游植物计数板上，在显微镜10×40 放大倍数下对浮游植物进行分类鉴定计数，每个样品须计数100个视野且次数不低于3次，结果取3次计数平均值。浮游植物生物量计算公式如下：

N＝A×Vs×n/(Ac×Va)

其中N 表示每升水样中浮游植物数量，A 表示计数框面积，Vs表示浓缩后水样体积，n表示计数所得浮游植物数量，Ac 表示计数面积，Va 表示计数框体积。

二、结果

1.培养用水水质指标和环境条件

池塘水质：溶氧5.25 毫克/升、总磷0.164 毫克/升、总氮2.187 毫克/升、亚硝酸盐0.016 毫克/升、化学需氧量(COD)10.5 毫克/升、氨氮0.250 毫克/升、pH 7.8。每天监测水温、气温、光照等环境条件。实验期间每天8:00-16:00，水温为22～35℃，光照强度为10 000～125 000 勒克斯。

2.不同小球藻接种量对培养效果的影响

不同接种量组实际培养液效果见图1，培养液水体明显变绿、变浓。1∶2的接种比例组，第2天小球藻细胞浓度达最高，为3.82×107个/毫升；1∶5 的接种比例组，第3 天小球藻细胞密度达最高，为3.81×107个/毫升；1∶10的接种比例组实验期间浓度缓慢增加，最高为1.51×107个/毫升。1∶2 接种组和1∶5 接种组小球藻生长性能、比增长速率显著优于1∶10 接种比例组(P＜0.05)，但1∶2 与1∶5 组的比增长速率无显著差异(P＞0.05)。

图1 室外小球藻培养效果

培养至第5 天，测定各实验组浮游植物丰度，结果显示，小球藻为1∶2、1∶5、1∶10组培养液中的绝对优势藻种，所占比例分别为99.17%、99.25%、92.15%，其他为隐藻、甲藻、硅藻。综上，按V(藻液)∶V(培养水体)为1∶2和1∶5接种培养小球藻，藻相好、生长快、浓度高、纯度高，培养液小球藻细胞纯度比例高达99%以上。结合藻种有效使用率和扩培效果，1∶5 的接种比例组更适合实际接种应用推广。

3.培养后期不同处理方式对小球藻培养效果的影响

培养至第10 天，不同补料量组培养液中小球藻密度变化情况表明，未补料组在第5天后小球藻细胞密度缓慢增加，至第7 天藻细胞密度达最高，为4.27×107个/毫升；补加初始双倍量培养基组，小球藻细胞密度在第6 天至第10 天持续降低，从4.14×107个/毫升降至2.72×107个/毫升，颜色由绿色变为黑褐色，伴有刺激性臭味；补加与初始等量培养基组在补料后小球藻密度增加，第6天为4.12×107个/毫升，第10 天增至5.43×107个/毫升，增加了1.31×107个/毫升。在培养结束后，未补料组和补加与初始等量培养基组小球藻为培养液中绝对优势藻种，所占比例分别为99.22%和99.37%；补加与初始等量培养基组小球藻占比最高，较未补加组提高了0.15%。

综上，在小球藻生长进入平缓期后补加与初始等量培养基可提高小球藻细胞密度，且小球藻细胞纯度比例高达99%以上，可降低成本、提高小球藻培养效率。

三、讨论

小球藻培育至高峰期后可进行补料，补料量与初始量相等，以获取更高浓度小球藻。每天要搅拌数次使藻相均匀，同时监测水温，超过35℃时需要加盖防晒网，以防止水温过高。

小球藻作为有益藻，可立体高效供氧，调控养殖水体微生态环境，广泛应用于鱼、虾、蟹生态养殖。姚冬梅等(2022)发现，在凡纳滨对虾池塘接种小球藻，接种小球藻的试验组较对照组蓝藻门生物平均密度下降76.32%、绿藻门生物平均密度上升70.32%，说明池塘接种小球藻可以有效抑制蓝藻的生长，实现蓝藻的生物防治。目前小球藻的培养模式主要为封闭式管道培养及开放式培养。蒋礼玲等(2010)研究发现，在柱状光生物反应器中培养小球藻，最高密度仅为0.57×107个/毫升，充入烟道气(含有10%～15%的CO2)组小球藻密度增加10 倍。充入CO2增加了成本且易污染藻种。小球藻开放式培养模式成本虽低，但占地面积大，藻种密度低。李大高等(2015)发现池塘培育小球藻浓度为(7～10)×106个/毫升，且需严格控制原生动物等敌害生物。本研究建立了一种小球藻塘口规模化培养新模式，在室外塘口培养，只需简单操作和合理接种，培养效果有保障，藻相稳定且培养纯度达99%以上，浓度可高达5.43×107个/毫升，培养成本低，适合在中小型养殖户中推广应用。