柠檬酸调节水体酸碱度抑制黄丝藻藻华的研究

王爱卿，杨仕豪，李西雨，潘连德

(上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海201306)

摘要：用柠檬酸调节试验水体pH值，并保持在5.0、5.5、6.0和6.5四个梯度下，将采自养殖池塘的黄丝藻(Tribonema sp.)藻华的10 g藻丝体放入试验水体，每隔48 h采样一次，观察黄丝藻藻丝体外部形态、显微结构的变化。同时测定其叶绿素a(Chl a)、丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性。结果表明：96 h黄丝藻藻丝体大量下沉，有些藻丝体断裂，无气泡产生，水体开始混浊；192 h水体混浊、藻丝体断裂并溶解的现象进一步明显；192 h各试验组藻细胞内叶绿体集于中央，并呈现不同程度的解体，细胞结构也变得模糊，细胞质膜与细胞壁之间的空隙增大。四个试验组Chl a含量明显低于对照组。对于SOD、CAT的活性，pH5.0的试验组呈现下降趋势，而pH 5.5、6.0、6.5的试验组呈现先增长后下降的趋势；各个试验组MDA明显高于对照组，这说明192 h后黄丝藻藻丝体受到严重的破坏，开始解体、死亡。试验得出结论：用柠檬酸降低水体pH值，可以有效抑制或杀死了黄丝藻，从而控制了黄丝藻藻华。

关键词：柠檬酸；黄丝藻(Tribonema sp)；叶绿素a；抗氧化酶

在养殖水体，丝状藻类旺盛生长形成藻华(俗称青苔)，消耗水体中无机盐，释放有毒物质，使水质变得清瘦，毒害水生生物[1]。虾、蟹颊部、额部、基关节附着丝状藻类，会使虾、蟹活动困难，进食减少，严重时致其窒息死亡[2]。在景观水体，藻类大量爆发时既影响水体的景观效果，也使水体散发异味，对周围环境造成影响[3]。

目前，常用控制藻类的方法主要有物理法[4]、化学法[5-7]和生物法[8-10]。尽管上述方法在短期内都能有效控制水体藻类，但长期使用会对生态系统产生压迫，并且经济成本高[11-12]。因此，需要寻找一种既能有效控制藻类，又对环境的破坏性小，便于长期操作的办法。

表层水体的pH是一个重要的环境因素，它能在很大程度上影响藻类种群的增长[13]。在排除其它外界环境因素的条件下，藻类只有在一定的pH值范围内才能生长良好，如果超出这个范围，藻类活性就会受到抑制或死亡[14]。藻类喜欢生长于偏碱性水体(pH7.7～9.4)，因此在一定的范围内，可以把养殖水体pH值调到偏酸性，进而可以抑制藻类生长[15]。Axelsson等[16]发现在酸性条件下，高浓度的金属和低浓度的营养盐对藻类的生长有间接抑制效果，而氢离子的浓度对藻类有直接的破坏作用。

目前，针对丝状藻类的研究主要是其作为初级生产者对周围环境的影响[17-20]，而作为有害藻华的相关研究较少[5,21]。本研究利用柠檬酸改变水体pH值来进行黄丝藻(Tribonemasp)藻华的抑制试验，探索养殖水体黄丝藻等丝状藻藻华的预防与控制的新思路和新方法。

1试验材料

柠檬酸购自国药集团化学试剂有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

黄丝藻藻华采集于上海浦东新区临港新城一个养殖池塘，去除其上所附的杂草、螺类，放入超白玻璃缸内，注入河水，室内自然光照下暂养、备用。

2试验方法

2.1柠檬酸添加频率的确定

分别配置pH值5.0、5.5、6.0、6.5四个不同梯度的柠檬酸溶液，并设对照，每组设3个重复。连续进行pH值测定，以便于观察水体pH值的变化趋势，确定柠檬酸添加频率。

表1　不同处理组12 h 后的pH值变化

注：偏离量平均值中数据为平均值±标准差，后缀相同字母之间表示没有显著差异(P>0.05),不同字母者表示差异显著(P<0.05)，下同。

由表1可知，12 h各试验组pH值与设定值出现一定的偏差，就平均值而言，pH值5.5时，偏离程度最小，pH值为5.0时，偏离程度最大。对每一次的偏离量的绝对值进行平均后发现，4个处理之间pH值偏离值没有明显差异。所以，确定间隔12 h为柠檬酸的最佳添加时间。

2.2黄丝藻藻丝体培养方法和条件

分别称取10 g的黄丝藻藻丝体，蒸馏水洗净，放于3 L含有BG11培养基的对照组(pH=7.8)与加有柠檬酸调节pH值为5.0、5.5、6.0、6.5四个不同梯度的BG11培养基中，日光灯照射，光照度为 2 000 lx，光暗比为 12 h∶12 h，温度22 ℃，充气培养。

2.3pH对黄丝藻藻丝体结构的改变

肉眼观察不同pH值条件下黄丝藻藻丝体颜色、沉降、光合作用产生的气泡，水体混浊现象及藻丝体的断裂与自溶等表观特征。

使用显微镜(型号：BH-2，×20倍、×40倍)分别观察不同pH值条件下黄丝藻细胞壁、细胞膜、色素体的变化。

2.4pH对黄丝藻藻丝体Chla含量的影响

每隔48 h取一次样，测定Chla含量，连续进行192 h。取0.12 g黄丝藻藻丝体，用吸水纸吸干，放入具塞刻度试管，迅速转移至冰箱冷冻室冷冻12 h和以上或过夜，取出后立即加入15 mL已经预热(80 ℃)的95%乙醇中，并在恒温水浴锅中80 ℃萃取2 min，紧接着使用超声波细胞粉碎仪(冰浴中)进行粉碎，放入4 ℃冰箱黑暗静置4 h后，转入有刻度的离心管中，定容至15 mL，离心10 min(4000 r/min)，取上清液于分光光度计上测定663 nm、645 nm和630 nm下的吸光度值[22]。Chl a含量按照下列公式计算：

Ca=[11.64(OD663)-2.16(OD645)+0.10(OD630)]×V/M

式中：Ca为1 g藻丝体中所含的Chl a量(mg/g)；V为定容的体积(L)；M为称取的藻丝体的重量(g)。

2.5pH对黄丝藻藻丝体两种抗氧化酶活性及MDA含量的影响

每隔48 h取一次样，测定黄丝藻藻丝体两种抗氧化酶活性及MDA含量，连续进行192 h。参考Furey等[23]方法，取0.20 g的黄丝藻藻丝体，吸干、剪碎，加入冷却至4 ℃的0.05 mol/L磷酸缓冲液5 mL(pH=7.82，内含4 mmol/L EDTA-Na2)，在冰水浴中用超声波细胞粉碎仪破碎，匀浆液8000 r/min、4 ℃下离心10 min，收集上清液，用于测定SOD、CAT、MDA，样品处理完后24 h内测定完毕。

2.6数据分析

试验数据用SPSS13.0单因素方差分析(One-way ANOVY)进行Duncan′s法多重比较，P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著。

3结果

3.1pH对黄丝藻藻丝体结构的改变

3.1.1pH对黄丝藻藻丝体外部形态的改变

从图1、图2可以看出，试验组藻类由于受到不同程度的损害，96 h和192 h试验组与对照组出现了明显的差异性。192 h与96 h相比，pH 6.5的试验组，水体混浊度明显增加，无气泡产生，藻类颜色变为黄褐色，藻丝体断裂，沉于瓶底。pH 6.0的试验组混浊度增加，数量明显减少。pH 5.5和5.0的水体，几乎看不到藻丝体，说明基本已经溶解。

图1　96 h不同pH值条件下黄丝藻藻丝体外部形态结果

图2　192 h不同pH值条件下黄丝藻藻丝体外部形态结果

3.1.2pH对黄丝藻藻丝体显微结构的改变

从图3、图4中可以看出，192 h四个试验组与对照组出现了明显差异，pH5.0的试验组中毒现象最为严重，黄丝藻藻丝体接近死亡，与对照组相比，试验组的色素体集中于细胞中央，含量明显减少，颜色呈黄灰色，细胞结构也变得模糊，细胞质膜与细胞壁之间的空隙增大。随着pH值升高，则中毒现象减轻。pH值5.5、6.0、6.5的试验组藻类色素体含量高于pH值5.0的试验组，黄绿色藻类较多，这说明处理192 h各个试验组叶绿体受到破坏，叶绿素的合成受到阻碍。

3.2pH对黄丝藻藻丝体Chla含量影响

由表2，图5可知，在加入柠檬酸48 h，对照组pH值8.2，黄丝藻藻丝体Chla含量为0.972 mg/g，而pH值5.0、5.5、6.0、6.5实验组含量分别为0.558、0.605、0.707、0.822 mg/g，试验组与对照组表现明显的差异性。pH值5.5、6.0、6.5的试验组含量呈现先增长后下降的趋势，而pH值5.0的试验组一直保持下降趋势。说明pH值5.0的较酸性环境，使黄丝藻细胞受到破坏，所以没有进行增殖便开始死亡。而其它试验组由于受到酸性环境的有效刺激，促进其增长，但是随着时间的延长，则出现了抑制现象。

3.3pH对黄丝藻藻丝体两种抗氧化酶活性、MDA含量的影响

3.3.1pH对黄丝藻藻丝体SOD活性的影响

由表3，图6可以看出，pH值5.5、6.0、6.5的环境条件下，SOD呈现先增长后下降的增长趋势，而pH值5.0的试验组表现为下降趋势，但总体上都低于对照组。

图3　192 h后黄丝藻藻丝体显微结构中毒结果(×20)

pHChla含量/(mg/g)48h96h144h192h对照0.972±0.092a1.226±0.075a1.465±0.136a1.537±0.112a5.00.558±0.011d0.445±0.049c0.410±0.012d0.237±0.052e5.50.605±0.058cd0.833±0.082b0.644±0.018c0.464±0.021d6.00.707±0.08bc0.975±0.058b0.926±0.041b0.614±0.082c6.50.822±0.046b1.156±0.123a1.319±0.133a0.878±0.109b

图4　192 h后黄丝藻显微结构中毒结果(×40)

pHSOD活性/(U/mgprot)48h96h144h192h对照55.369±0.798c69.154±0.700a71.195±1.429a70.747±1.811a5.036.365±0.765e32.576±2.111c26.893±1.634c10.809±1.864e5.546.254±1.484d51.453±2.184b48.972±1.549b29.037±1.351d6.062.934±1.189b66.685±1.097a71.413±1.820a37.857±2.192c6.568.393±2.600a68.713±1.435a70.304±1.130a65.369±2.989b

图5　不同pH值对黄丝藻藻丝体叶绿素a含量的影响

图6　不同pH值对黄丝藻藻丝体SOD活性的影响

3.3.2柠檬酸对黄丝藻藻丝体CAT活性的影响

由表4，图7可知，试验组与对照组出现明显差异性，pH值5.5、6.0、6.5的试验组呈现先增长后下降的趋势，而pH值5.0的试验组保持下降趋势，并且都明显低于对照组。

表4　不同pH值对黄丝藻藻丝体CAT活性的Duncan′s比较

3.3.3pH对黄丝藻藻丝体MDA含量的影响

由表5，图8可知，试验组MDA含量明显高于对照组，192 h各个试验组呈先增长后下降的趋势，并且酸性越强，MDA含量越高。说明试验组黄丝藻藻丝体由于受到酸性环境的胁迫，细胞遭到破坏程度最严重。

表5　不同pH值对黄丝藻藻丝体MDA含量的Duncan′s比较

注：表中MDA单位：nmol/mgprot

4讨论

根据黄丝藻藻丝体结构的变化，叶绿素a含量和各种抗氧化酶指标的测定结果发现，192 h各个试验组与对照组相比，表现出明显的抑制效果。并且抑制率与酸度成正比关系。抑制率从高到低的顺序依次为：pH 5.0>pH 5.5>pH 6.0>pH 6.5>对照组。针对调节pH值来控制丝状藻的相关研究仍较少，但是Wang等[15]的研究表明：使用CO2调节试验水体pH值在5.5和6.0时，可以直接杀死铜绿微囊藻，而在pH值6.5的水体，铜绿微囊藻的生长受到抑制，但不会出现死亡。李静会等[24]

图7　不同pH值对黄丝藻藻丝体CAT活性的影响

图8　不同pH值对黄丝藻藻丝体MDA含量的影响

使用醋酸治理玄武湖蓝藻藻华实验结果表明：当平均用量为26.87 g/m3，水体表面pH值为5.5时，实验区藻类总量下降了82.8%。这与本试验研究有相似之处，说明一定的酸性条件可以抑制或杀死藻类。但对于不同的藻类，其抑制效果可能会有差异。对于其作用机理有两种推测，其一：过量的H+降低碳酸酐酶活性，从而使CO2浓缩机制受到影响，进而导致藻类死亡[25]；其二：过量的H+对藻细胞的内部结构有直接的破坏作用，从而使光合作用受到影响；特别是降低细胞质和叶绿体内pH值，从而阻止卡尔文循环，因此降低了开放式光合系统II反应位点数量[26]。

Chla在光合作用的光能收集、传递和转化中起不可替代的作用，其含量的高低直接影响植物对于光合能量的利用，进而影响到光合能量的净积累，最终会以产量和生物量的形式表现出来[27]。本研究中四个试验组的Chla含量明显低于对照组，这可能是由于酸性条件抑制了黄丝藻藻华Chla的合成或造成了Chla的分解。有研究表明：pH值5.5、6.0、6.5的环境条件下，铜绿微囊藻和鱼腥藻的Chla含量明显下降[16]。这与本试验的结果相似。

藻类光合作用过程包括光化学过程和酶促过程。藻类光合磷酸化过程的速度受酶控制，而酶在水溶液环境中的解离状态和行为，都受到氢离子浓度的影响。氢离子浓度对酶促反应的速度不仅有明显的影响，而且影响机理也不同[28]。对于酸性条件下，藻类各种抗氧化酶活性的变化目前还没有研究。本试验的研究结果显示除pH值5.0的试验组藻丝体SOD、CAT活性随时间呈下降趋势外，其它试验组均表现为先增长后下降的趋势，表明了当过度的酸性环境刺激，会造成抗氧化酶系统的失活，而适度的酸性环境胁迫会增强抗氧化酶活性，从而加强了清除活性氧的综合能力。但是随着处理时间的延长和胁迫程度的加重，各种抗氧化酶协同清除活性氧的综合能力下降，就会积累更多的活性氧，产生严重的氧化胁迫，进而影响细胞活性。

结合试验结果和分析表明，在使用柠檬酸调节水体pH值在5.0～6.5之间，对黄丝藻藻丝体都有一定的抑制效果。因此，在黄丝藻等丝状藻藻华爆发的养殖水体，可以通过人为方法适当改变水体pH值以达到抑制丝状藻藻华的目的。

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