蛋白核小球藻的培养体系优化研究

于枭燕，陈 丹，邢向远，赵国群，3，王 勇＊

（1.河北科技大学 食品与生物学院，河北 石家庄 050000；2.阿尔格河北生命科学有限公司，河北 辛集052360；3. 河北省发酵技术创新中心，河北 石家庄 050000）

蛋白核小球藻作为一种单细胞绿藻，又被简称为小球藻[1]。在农业上，因其可以改善土壤营养状况，对作物果实提质增产，促进植物种子发芽[2]，小球藻作为绿色化生物肥料受到广泛关注。此外，因小球藻可以吸附并排除毒素，可以抑制病原菌的生长繁殖。尽管小球藻的应用前景广阔，目前，小球藻培养仍存在着培养周期长、藻体密度低的技术瓶颈，这进一步提高了生产成本，限制了藻体的高效规模化生产。

本研究聚焦于蛋白核小球藻的培养工艺优化，分析了培养基构成、培养体系的装液量和接种量、培养基初始pH 等因素对蛋白核小球藻生长的作用影响，进一步优化了培养工艺，为小球藻的高效规模化生产提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 藻株与培养基

蛋白核小球藻，由阿尔格河北生命科学有限公司提供。

藻体培养采用BG-11 培养基[3]。

1.1.2 实验试剂

葡萄糖（分析纯）购自天津市百世化工有限公司，乙二胺四乙酸二钠（分析纯）购自天津欧博凯化工有限公司，IAA（分析纯）购自上海易恩化学技术有限公司，其它试剂均为市售分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 小球藻种子液的制备

将BG-11 培养基装入250 mL 三角瓶内（装液量100 mL），灭菌条件为121 ℃，保温20 min。将适量蛋白核小球藻斜面培养物接入三角瓶，培养条件为28℃，光照强度2400 Lux，摇床转速140 rpm。

1.2.2 小球藻培养条件

取小球藻种子液转接入灭菌后的BG-11 培养基，接种率为10%，发酵培养条件为光照2400 Lux，光暗比24∶0，摇床转速140 rpm，温度28 ℃。

1.2.3 碳源对小球藻生长的影响

碳源分别采用等摩尔氮浓度（0.19 mmol/L）的葡萄糖、乙酸钠、NaHCO3、Na2CO3。进一步采用浓度梯度为1.0～10.0 g/L 的葡萄糖，以确定葡萄糖浓度对小球藻生长的影响。光照培养时间为7 d。

1.2.4 氮源对小球藻生长的影响

在葡萄糖浓度为7.0 g/L 条件下，氮源分别采用等摩尔氮浓度（17.6 mmol/L） 的NH4H2PO4、NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、尿素和NaNO3。进一步采用浓度梯度为0.3～3.0 g/L 的尿素，以确定尿素浓度对小球藻生长的影响。光照培养时间为7 d。

1.2.5 无机盐对小球藻生长的影响

在7.0 g/L 葡萄糖和1.5 g/L 尿素条件下，采用浓度梯度为25.0～100.0 mg/L 的K2HPO4，光照培养时间为7 d。

在7.0 g/L 葡萄糖、1.5 g/L 尿素和0.075 g/L K2HPO4条件下，采用浓度梯度为35.0～1 000.0 mg/L的MgSO4，光照培养时间为7 d。

1.2.6 植物激素和维生素对小球藻生长的影响

在优化后培养基中分别添加浓度梯度为0.0～10.0 mg/L 的IAA；分别添加浓度梯度为0.0～100.0 μg/L的维生素B12；分别添加浓度梯度为0.0～1000.0 μg/L的生物素；光照培养7 d，以确定IAA、维生素B12及生物素对小球藻生长的影响。

1.2.7 接种量对小球藻生长的影响

当培养基组成为7.0 g/L 葡萄糖，1.5 g/L 尿素，0.075 g/LK2HPO4，0.15 g/LMgSO4，1.0 mg/LIAA，10 μg/L维生素B12和100 μg/L 生物素，其他成分不变时，采用接种量梯度为5～20%，光照培养7 d，以确定接种量对小球藻生长的影响。

1.2.8 培养基初始pH 与初始装液量对小球藻生长的影响

当培养基组成为7.0 g/L 葡萄糖，1.5 g/L 尿素，0.075 g/L K2HPO4，0.15 g/L MgSO4，1.0 mg/L IAA，10 μg/L 维生素B12和100 μg/L 生物素，其他成分不变时，采用培养基初始pH 梯度为6.0～10.0，250 mL 三角瓶装液量梯度为80～140 mL，光照培养7 d，以确定培养基初始pH 和装液量对小球藻生长的影响。

1.2.9 蛋白核小球藻培养条件优化

基于接种量、培养基初始pH 及初始装液量，开展3 因素3 水平的正交实验，正交实验设计见表1。

表1 正交实验设计表

1.2.10 分析方法

小球藻的生长测定采用血球计数板计数法。将待测藻液摇匀，取8 μL 适当稀释后藻液沿盖玻片边缘缓慢充满计数室。静置5 min，放在显微镜下进行计数。

2 结果与分析

2.1 碳源对小球藻生长的影响

如图1（a）所示，当采用葡萄糖和乙酸钠时，藻细胞密度分别达到了2.71×106和2.09×106个/mL。本研究结果与刘茜等[4]在碳源优化分析中所得结果一致。如图1（b）所示，当将葡萄糖浓度从1.0 g/L 增加到7.0 g/L，藻细胞密度从2.9×106个/mL 提升到6.75×106个/mL。过高浓度的葡萄糖可能会对小球藻的生长产生抑制效应。

2.2 氮源对小球藻生长的影响

在采用不同氮源条件下（图1（a）），尿素对小球藻生长促进最明显，藻细胞密度达到了6.96×106个/mL。在无机氮源中，NaNO3为氮源时，小球藻细胞密度为6.48×106个/mL，略低于尿素条件。尿素作为小球藻的最适氮源这一结论也被葛珍珍等[5]研究报道。因此，本研究采用氮源为尿素。如图1（b）所示，当尿素浓度由0.3 g/L 提升到1.5 g/L 时，小球藻细胞浓度逐渐增高，当尿素浓度为1.5 g/L 时，藻细胞密度达到7.33×106个/mL，比不添加尿素的对照组提高了34%。当尿素浓度超过1.5 g/L 时，小球藻生物量有所下降。因此，小球藻的最适尿素浓度为1.5 g/L。

2.3 无机盐对小球藻生长的影响

磷通过作用于小球藻细胞膜、核酸、叶绿素等的合成对小球藻的生长及代谢产生影响[6]。如图2 所示，当磷源浓度为75.0 mg/L 时，藻细胞密度最高，为7.43×106个/mL，比对照组提高了11.2%。但是当磷源浓度达到100.0 mg/L 时，蛋白核小球藻的生长受到一定抑制，藻细胞密度略有下降。已有研究表明，当磷源浓度低于70.0 mg/L，小球藻的生长速率和生物量与磷源含量呈正相关，且最适磷源浓度为70.0 mg/L[7]。本研究中小球藻最适磷浓度采用75.0 mg/L。

图2 磷酸氢二钾和硫酸镁对小球藻生长的影响

镁作为叶绿素和某些辅酶的主要构成成分，对小球藻的生长具有重要意义[8]。如图2 所示，当MgSO4浓度在0～150 mg/L，小球藻细胞密度随MgSO4浓度的增加而增加，小球藻最大藻体密度为7.88×106个/mL，比对照组提高了15.9%。当硫酸镁浓度超过150 mg/L 时，小球藻的生长受到一定程度的抑制。本研究中小球藻的最适MgSO4浓度为150 mg/L。

2.4 植物激素和维生素对小球藻生长的影响

2.4.1 IAA 对小球藻生长的影响

IAA 浓度对小球藻生长的影响如图3 所示，当IAA 浓度在0.05 mg/L～10 mg/L 时，对小球藻的生长均有促进作用。当IAA 浓度低于1.0 mg/L 时，小球藻的细胞密度随着IAA 浓度的增加而增大，当IAA 浓度为1.0 mg/L 时，小球藻细胞密度最高达8.13×106个/mL，为对照组的1.07 倍。然而，当IAA 浓度大于1.0 mg/L 时，小球藻的生长受到一定抑制。本研究确定最适IAA 浓度为1.0 mg/L。

图3 IAA、维生素B12 和维生素B7 对小球藻生长的影响

2.4.2 维生素B12对小球藻生长的影响

王士伦等[9]发现添加适量的维生素B12能够促进小球藻的生长和叶绿素含量的提升。由图3 可知，在维生素B12浓度为0～10 μg/L 时，蛋白核小球藻生物量随着维生素B12浓度的增大而增加，小球藻细胞密度最高为9.73×106个/mL，比对照组提高了12%。当维生素B12浓度大于10 μg/L 时，其对小球藻的促进效果有所下降。本研究确定维生素B12最适添加量为10 μg/L。

2.4.3 生物素对小球藻生长的影响

生物素（也称为Vitamin H 或B7）作为辅因子对生理代谢产生重要意义[10]。由图3 可知，在生物素浓度为低于100 μg/L 时，蛋白核小球藻的生物量随着生物素浓度的增加而增大，蛋白核小球藻的生物量最高为1.08×107个/mL，比对照组提高了15.6%。当生物素浓度超过100 μg/L 时，小球藻的生物长受抑制。本研究中生物素的最适添加量为100 μg/L。

2.5 接种量对小球藻生长的影响

由图4 可知，当小球藻的接种量为5%时，藻细胞生长缓慢，生物量较其他接种组低。当接种量为10%时，小球藻的生物量最高，为1.04×107个/mL，比5%接种量组提高了14.7%。当接种量大于10%，小球藻的生物量随接种量增大而逐渐降低。本研究中小球藻培养的最适接种量为10%。

图4 接种量、培养基初始pH 及装液量对小球藻生长的影响

2.6 培养基初始pH 及初始装液量对小球藻生长的影响

如图4 所示，当培养基初始pH 为7 时，小球藻生物量最高，为1.05×107个/mL。当pH 达到10 时，小球藻的生物量最低，较pH7 处理组下降了28.3%。随着装液量的增大，小球藻的细胞密度呈现先升高后降低的趋势。当装液量为100 mL 时，藻细胞密度达1.1×107个/mL。显然，装液量过大会造成限制气体传质，装液量过低又会导致底物浓度受限。

2.7 蛋白核小球藻的培养条件优化

在以上基础上，采用葡萄糖7.0 g/L、尿素1.5 g/L、K2HPO475 mg/L 及MgSO4150 mg/L，进行3 因素3 水平的正交优化实验（表2）。

表2 正交实验设计及结果

由表3 可知，培养基初始pH 和接种量对蛋白核小球藻细胞密度影响显著。最优培养条件为接种量10%，培养基初始pH8，装液量100 mL。最优条件下，蛋白核小球藻的生物量为1.16×107个/mL。

表3 方差分析表

2.8 小球藻在优化条件下的生长曲线

将小球藻的种子液接种至优化培养基中，在优化培养条件下进行发酵培养（图5）。当培养时间为10d时，小球藻的藻细胞数达到峰值为1.37×107个/mL。培养时间超过10d 后，小球藻细胞密度达到稳定。魏东等[11]发现小球藻培养10 天后生长基本稳定，与本研究结果一致。因此，本研究中小球藻在优化条件下发酵周期为10d。

图5 小球藻在优化条件下的生长曲线

3 结论

本研究确定了蛋白核小球藻培养的最适碳氮源及浓度，阐明了无机盐、植物激素和微生素对微藻生长的影响。在优化培养基构成为葡萄糖7.0 g/L、尿素1.5 g/L、K2HPO475 mg/L、MgSO4150 mg/L，IAA 1 mg/L、维生素B1210 μg/L 和生物素100 μg/L 条件下，小球藻生物量达到1.08×107个/mL。确定了最佳培养条件为接种量10%，培养基初始pH8，装液量100 mL。最佳条件下，蛋白核小球藻的生物量达到1.16×107个/mL，且在此条件下小球藻的发酵周期为10 d。