温度对中型指环虫产卵和孵化的影响

张效平 李文祥 艾桃山 吴山功邹 红 王桂堂

(1.中国科学院水生生物研究所, 武汉 430072; 2.中国科学院大学, 北京 100049;3.武汉中博水产生物技术有限公司, 武汉 430207)

随着鱼类养殖密度的提高和养殖环境的恶化,单殖吸虫病的发生日益频繁和严重, 给水产养殖造成较大的经济损失[1,2]。单殖吸虫一般寄生于鱼类的鳃和体表, 以其后吸器的几丁质结构插入鱼类组织,破坏鳃及皮肤[3], 可刺激鳃细胞分泌过多黏液, 引起鳃丝黏连和坏死, 影响鱼类呼吸[4],也可破坏鱼类体表组织, 引起细菌、真菌和病毒的继发性感染, 导致鱼苗甚至成鱼的大量死亡[5]。

中型指环虫(Dactylogyrus intermedius)是寄生于鲫(Carassius auratus)、鲤(Cyprinus carpio)鳃部一种较常见的单殖吸虫, 分布广泛, 在国内外均有发现和报道[6—8]。近年来, 国内外的一些学者研究了中草药提取物对中型指环虫的杀灭效果[9—11], 但是还没有中型指环虫生活史方面的研究报道。由于单殖吸虫生活史的每一阶段都极大的受制于温度, 其产卵、孵化和纤毛幼虫的生长发育速度与温度密切相关[12,13]。本实验将以金鱼(Carassius auratus)鳃部的中型指环虫为研究对象, 研究在离体条件下温度对中型指环虫产卵和孵化的影响。这将为研究有效的生态控制技术和药物防治方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

实验鱼购自武汉市武昌区八一路花鸟市场, 将金鱼养在盛有曝气自来水的水族箱中。

1.2 中型指环虫的收集

用MS-222将金鱼麻醉后, 剪下鳃片, 放在载玻片上, 在解剖镜下进行观察。当发现指环虫时, 迅速将其剥离下来, 立即放到盛有少量曝气自来水的 24孔板中, 并对指环虫进行清洗。在倒置显微镜下观察指环虫的形态特征, 如果指环虫虫体的体长在0.24—0.38 mm, 中央大钩较短, 钩尖平直, 其基部的背叶和腹叶分叉明显, 背叶较短, 联接棒单一,交配管呈斜管状, 基部较宽, 且带有基座[14], 可鉴定为中型指环虫, 并将收集到的虫体用来产卵和孵化实验。

1.3 中型指环虫的产卵

将收集的中型指环虫放到盛有曝气自来水的24孔板中, 一孔一虫, 分别置于 10、22、30、35℃的生化培养箱和4℃的冰箱内, 前5h内每隔1h取出观察一次, 之后每2h观察一次, 记录每条指环虫产卵的数量, 直至虫体死亡或连续 12h没有产卵时实验终止。

1.4 虫卵的孵化

收集到中型指环虫产下的虫卵, 放到盛有曝气自来水的24孔板中, 分别置于10、22、30、35℃的生化培养箱和 4℃的冰箱内, 在眼点出现之前每隔12h取出观察一次, 当出现眼点后每 2h观察一次,记录虫卵的变化情况, 直到所有虫卵都孵化或变黑死亡, 实验终止。

1.5 数据处理

在各温度下产卵数量的显著性检验采用单因素的方差分析(ANOVA), 孵化率采用卡方检验, 统计分析用软件SPSS 13.0。

2 结果

2.1 中型指环虫的产卵

产卵过程 在实验中观察到, 虫卵形成很快,当将中型指环虫移入盛有曝气自来水的 24孔板后,第一枚卵在1min之内就可排出。第一枚卵排出后大约 2min, 另一枚卵在后面接着开始形成, 在显微镜下可以清楚地看到卵粒的形成和增大的过程。在虫卵形成过程中, 虫体做波浪状的收缩和舒张运动,虫卵越来越大, 大约6、7min后虫卵完全成熟, 排出体外。但是后面虫卵的形成时间和产卵过程越来越长。

卵的形态 在所观察的正常卵中(能够孵化出纤毛幼虫的卵), 除了小部分为圆形, 大部分为梨形, 长约 30 μm; 虫卵颜色较深, 后端有一个卵柄;虫体最后产出的几枚虫卵, 形状一般不规则, 颜色较浅, 近透明, 大小不一, 一般小于正常卵, 而且卵壳较薄, 容易破裂, 这些非正常卵不能孵化出幼虫(图 1)。

图1 中型指环虫在离体条件下所产的正常卵(左)与非正常卵(右)Fig.1 Normal (left) and abnormal (right) egg of Dactylogurus intermedius

温度对中型指环虫产卵的影响 在 4℃条件下, 大部分中型指环虫直到死亡也不产卵。只有少数已怀有发育完全的卵粒的中型指环虫会产一枚卵。在此温度条件下, 中型指环虫成虫最长存活时间为9d。

在 10—35℃温度范围内, 平均产卵量随着温度的升高而增加, 其平均产卵量分别为 3.30、4.10、4.13和 4.24枚/虫(图 2), 统计结果显示： 在 35℃条件下的产卵量明显高于10℃(P< 0.05), 其他温度条件下的平均产卵量没有显著性差异; 中型指环虫的产卵速率随着温度的升高而加快, 产卵维持的时间分别为4d、23h、15h和11h。

图2 不同温度条件下中型指环虫的平均产卵量(n代表中型指环虫的数量)Fig.2 Mean egg production of Dactylogyrus intermedius at 10℃,22℃, 30℃ and 35℃ (n represents the number of D.intermedius examined)

2.2 中型指环虫虫卵的孵化

图3 中型指环虫虫卵在孵化过程中的变化Fig.3 Stages of Dactylogyrus intermedius in egg hatching

虫卵的孵化过程 刚排出的虫卵为灰黑色, 当虫卵在 22℃孵育 24h后, 开始出现黑色眼点(图 3a)。在孵育2d后, 纤毛幼虫的轮廓明显, 还可看到纤毛幼虫后吸盘上的小钩(图 3b)。有时可见虫体在卵壳内蠕动, 以头部顶卵壳上的卵盖。大约在孵化 96h后, 大部分幼虫顶破卵盖而成功钻出, 留下一个空壳(图 3c)。有些幼虫在蠕动的过程中, 头部偏离了卵盖的位置, 无法从卵盖处钻出, 而是从中间或后端顶开一个洞而钻出。还有一部分幼虫在钻出的过程中, 只有头部钻出卵壳而身体后端却被卡在卵壳内, 造成死亡。没有钻出卵壳的纤毛幼虫则死亡, 慢慢变黑。

纤毛幼虫的形态 刚孵化出的纤毛幼虫呈圆筒状, 两端稍尖, 两对眼点大而清晰; 后吸盘具有若干对小锚钩, 且小锚钩在不停地做伸缩运动, 大锚钩收缩在体内; 纤毛幼虫具有三环纤毛, 分别分布在前部、中部和尾部(图4), 纤毛不停地在水中摆动, 纤毛幼虫有时静止在某一水层, 有时又非常活跃, 时而急速前行, 时而做“8”字形运动, 并不时地以头器与孔壁接触。

温度对中型指环虫孵化的影响 在 4℃条件下, 中型指环虫虫卵不能孵化, 但是将虫卵放在 4℃条件下保存一周后, 再取出放在室温(约 27℃)下, 虫卵能成功孵化,且孵化率达到60%。

图4 刚孵化的纤毛幼虫的形态Fig.4 Morphology of newly hatched oncomiracidia of Dactylogyrus intermedius

在 22℃条件下, 中型指环虫的孵化率最高,为 72.7%, 其次是 10℃,而在30℃和35℃条件下的孵化率最低, 约 50%(图5)。卡方检验结果显示 4种温度条件下的孵化率无显著差异(P>0.05)。随着温度的升高,虫卵的孵化速度明显增加, 即孵化的时间逐渐减少, 在 10℃下, 中型指环虫卵最快需要 24d才能孵化, 在 22℃下, 虫卵在第2d即开始出现眼点, 3d后开始孵化, 而当温度升至30℃和 35℃时, 虫卵的平均孵化时间也分别降至42h和26h。纤毛幼虫最长存活时间随着温度的升高而减少, 在 4个温度条件下的最长存活时间分别为4d、3d、56h 和 34h。

3 讨论

3.1 离体条件下卵的形态和产卵速率以及温度对产卵速率的影响

在离体条件下, 中型指环虫最后产出的几枚卵在大小、形状和颜色等特征上与正常卵差距明显,而且不能孵化出幼虫。卵的形成需要消耗虫体的营养物质, 而在离体条件下, 随着虫卵不断的形成和排出, 成虫体内的营养物质逐渐被消耗, 由于得不到充足的营养补充, 最后形成的几枚卵由于营养不足, 而出现异常。另外, 该指环虫前几枚卵的排出速率较快, 只需要几分钟, 而后面的产卵速率越来越慢,这应该与指环虫在离体条件下的应激产卵有关[15]。在鱼体上, 指环虫的产卵一般分为两种情况, 一种是产卵季节性很强, 只在某特定时期产卵, 由于事先积累大量卵, 因此产卵的速率很快; 另外一种情况是产卵季节性弱, 卵一经形成即产出, 产卵速率较慢、较稳定, 易受温度影响[16]。在本实验中, 成熟的中型指环虫虫体内只存在一枚虫卵, 并没有积累多枚卵, 产卵类型类似于后者。

指环虫的产卵速率与温度密切相关, 在10、22、30、35℃温度下, 中型指环虫的产卵维持的时间分别为4d、23h、15h和11h, 即产卵速率随着温度的升高而加快。当温度从 5℃升高到 18℃时, 单殖吸虫Discocotyle sagittata的产卵速率从 1.5枚/(虫·d)上升到 12枚/(虫·d)[17]; 当温度从 10℃升到20℃时,单殖吸虫Neoheterobothrium hirame的产卵速率也由 8.5 枚/(虫·h)上升到 32.55 枚/(虫·h)[18]。可见, 在一定温度范围内, 随着温度升高, 单殖吸虫的产卵速率也随着加快。

图5 不同温度条件下中型指环虫虫卵的孵化率(n代表虫卵的数量)Fig.5 Hatching rate of D.intermedius at 10℃, 22℃, 30℃ and 35℃(n represents the number of eggs)

3.2 温度对产卵量的影响

单殖吸虫的产卵量也受到温度的影响。在 4℃条件下, 中型指环虫基本上不产卵, 当温度从 10℃升到 35℃, 中型指环虫的平均产卵量从 3.30枚/虫上升至 4.24枚/虫, 且 35℃条件下的平均产卵量显著高于10℃的。秉伪指环虫(Pseudodactylogyrus bini)在 24h内的平均产卵量在 30℃最高, 在 5℃条件下秉伪指环虫基本上不产卵[19]。在 17.5℃条件下, 本尼登虫(Benedenia seriolae)和轭联虫(Zeuxapta seriolae)的平均产量均达到最高, 分别为61.4枚/虫和309.3枚/虫[12]。在14℃条件下, 小鞘指环虫(Dactylogyrus vaginalatus)的产卵量最大, 低于或高于此温度, 产卵量均下降[20]。不同的单殖吸虫种类, 其产卵量达到最大值的温度各不相同, 与小鞘指环虫、秉伪指环虫、本尼登虫和轭联虫相比, 中型指环虫产卵量达到最大值的温度更高。

3.3 温度对孵化速率和孵化率的影响

同样, 温度对虫卵的孵化速率和孵化率也都有较大的影响。在4℃条件下, 中型指环虫虫卵不能孵化, 在 10—35℃的温度范围内, 虫卵的孵化速率不断增加, 孵化率却在 22℃最高。在 15℃、20℃和 23℃三个温度条件下, 河鲈锚首吸虫(Ancyrocephalus mogurndae)的孵化速率随着温度的升高而加快, 而孵化率却在15℃时最高[21]。在13—21℃范围内, 本尼登虫虫卵的孵化率无明显差异, 均在 0.73—0.78;而轭联虫的虫卵在13℃下的孵化率要明显低于17.5℃和 21℃[12]。单殖吸虫Bivagina tai[22]和Neoheterobothrium hirame[23]的虫卵在高温条件下(30℃)孵化率均下降。秉伪指环虫的虫卵在34℃条件下可以发育, 但是却没有发现成功孵化, 且在 37℃条件下其虫卵的发育和孵化完全受到抑制[19]。可见, 单殖吸虫的孵化速率达到最大值时的温度往往高于孵化率达到最高值时的温度, 也就是说, 孵化速率达到最大值时的温度并不一定是最适的孵化温度。在35℃的高温条件下, 中型指环虫的虫卵还能成功孵化,孵化速率也是最快的, 但是孵化率却降低, 说明此温度已经对虫卵孵化产生一定的抑制作用。另外,本研究还发现在4℃低温保存7d后的虫卵仍能再成功孵化, 且孵化率没有明显降低。但是低温(5℃)处理Diplectanum aequans的虫卵后, 在室温(18℃)条件下的孵化率却显著降低[24]。可见, 温度对不同种类单殖吸虫的产卵、孵化等产生不同程度的影响。

通过本实验的结果, 可以初步得出, 当水温为22℃时, 中型指环虫的产卵数量和纤毛幼虫的存活时间都比较高, 且孵化率最高, 表明在该温度条件下, 中型指环虫种群增长迅速, 容易引起指环虫病的暴发和流行。

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