目前，针对越冬综合征的诱发因素主要从养殖管理等方面进行分析，如养殖密度太大、饵料质量有问题、秋冬水质管理不佳等，而病原学的研究尚没有统一的结论。2023年4月，溧阳市某渔场异育银鲫养殖暴发越冬综合征，死亡率较高。本研究对发病塘口进行采样，开展细菌性病原的研究，为做好江苏省越冬综合征的防控奠定基础。根据研究结果采取了系列防治措施，最终使病情得到有效控制。

一、材料与方法

1.样品采集和细菌分离

2023年4月，溧阳市某渔场异育银鲫发病，病鱼体表出血严重、大面积鳞片脱落，眼球突出明显，吃食率下降，每天病鱼死亡20～30 尾，持续1周左右，初步诊断为越冬综合征。

无菌采取鱼的病灶和脏器，划线接种于LB 固体培养基，28℃培养24 小时；挑取单个菌落，再次划线接种于LB 固体培养基进一步纯化。经两次分离纯化后的菌落，进行基因扩增。

2.气单胞菌管家基因扩增测序

按照试剂盒说明书提取细菌基因组，基于气单胞菌管家基因DNA 促旋酶B亚单位(gyrB)进行PCR检测。gyrB上下游引物与扩增片段大小如表1 所示。PCR 反应总体积为30 微升，其中含有2 微升基因组模板、1.3 微升上游引物和1.3 微升下游引物、15 微升PCR Mix 液以及10.4微升超纯水。取7微升PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，当出现预期条带后回收PCR 产物，PCR 产物回收后进行测序。结果通过BLAST 分析，与NCBI 数据库中现有的核酸序列进行同源性比对，确定菌株种属。

表1 PCR引物信息

3.气单胞菌特性分析

(1)斑马鱼致病性试验。挑取气单胞菌单菌落接种于BHI 培养基中，恒温培养24 小时。接下来用无菌PBS 进行10 倍比例稀释，把浓度分别调整至5.0×102～5.0×109CFU/毫升。然后以0.02 毫升/尾的剂量对每组斑马鱼进行腹腔注射，确保每组的细菌量分别为10～108CFU。阴性对照组斑马鱼仅注射0.02毫升PBS。每天定时观察记录斑马鱼的存活情况，持续一周，并使用Bliss算法计算斑马鱼半数致死量(LD50)。

(2)细菌胞外产物活性测定。细菌溶血性测定：蘸取试验菌株，分别划线接种于5%绵羊血营养平板上，28℃培养24小时，观察有无溶血活性。

(3)细菌最小抑菌浓度(MIC)的测定。先将试验菌株接种于BHI 液体培养基中，28℃培养18 小时，并校正菌液浓度为1.5×108CFU/毫升，然后以1∶1000浓度的生理盐水将其稀释。将药物以表2浓度梯度稀释，并依次加样加入96孔板中。将气单胞菌菌液稀释液加入96 孔板的各个孔中，加样完毕后将微孔板密封膜贴于孔板上，在37℃条件下孵育18～24 小时。通过观察，确定无细菌生长的孔位位置，该位置对应的梯度稀释浓度即为该抗生素的最小有效抑制浓度。

表2 药物敏感试验各供试药物浓度 微克/毫升

二、结果与分析

1.细菌鉴定

从发病鲫鱼的眼球、体表和肝脏中均分离到一株优势菌，菌落形状大小均如图1 所示，为圆形、隆起型、乳白色菌落，与气单胞菌菌落特点相似。gyrB 管家基因的PCR 扩增检测结果与NCBI基因库中现有的核酸序列进行BLAST分析和同源性比对，鉴定结果为温和气单胞菌，命名为LY2023001。

2.LD50测定

斑马鱼致病性试验结果如表3所示，计算株菌的LD50值。根据濮俊逸等对细菌致病力的分类，LY2023001 的LD50值为1.64×104CFU/尾，判定为强致病力菌株。

表3 动物回归感染试验及LD50值计算结果

3.细菌胞外产物活性测定

通过划线血平板，发现LY2023001具有溶血性(表4)。进一步的溶血活性试验结果显示，LY2023001的溶血性强于标准菌株ATCC7966，溶血价为1∶8。

表4 胞外产物活性测定结果

蛋白酶活性试验结果显示LY2023001具有较强的胞外蛋白酶活性，其胞外蛋白酶活性为0.334，远高于对照菌株ATCC7966的0.177。

4.药物敏感试验结果

由表5 可知，LY2023001 对恩诺沙星、硫酸新霉素、氟甲喹和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶敏感，而对其他4 种抗菌素耐药，其中对恩诺沙星最敏感，MIC 仅为0.125 微克/毫升，可以考虑作为首选药物。

表5 气单胞菌对不同抗菌药物的MIC值 微克/毫升

三、讨论

自从越冬综合征发病以来，全国水产技术推广总站多次组织专家学者对发病塘口进行采样，开展病原学研究。对来自多个养殖场病鱼内脏进行不同培养基的细菌分离，也未见大量细菌生长，分离获得的细菌主要为维氏气单胞菌、杀鲑气单胞菌和类志贺邻单胞菌。珠江水产研究所团队认为柱状黄杆菌是越冬综合征的主要病原；长江水产研究所团队认为当前黄颡鱼所患疾病以鮰爱德华氏菌感染引起的肠道败血症为主；浙江淡水水产研究所团队从患病黄颡鱼中分离到新的小RNA病毒。本研究中从发病的异育银鲫病灶处分离到一株优势菌，鉴定为温和气单胞菌，命名为LY2023001。

近年来由温和气单胞菌引起的草鱼、美洲鲥、黄颡鱼等鱼发病的情况也时有发生，具有一定的致病性。本研究中分离的LY2023001是一株强致病力菌株，LD50为1.64×104CFU/尾，具有较高的溶血活性和胞外蛋白酶活性。药敏试验结果显示，该菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、氟甲喹和磺胺甲噁唑、甲氧苄啶敏感，可以选用恩诺沙星作为治疗此次越冬综合征的首选药物。

根据药敏结果制定治疗方案。外用选择优质碘制剂泼洒2～3 次，施药间隔1 天。内服可以在饲料中添加恩诺沙星进行治疗，疾病治愈后停掉抗生素，改为保肝药、维生素及乳酸菌继续投喂7～10 日天。治疗1 周后，病鱼出现充血、表皮溃烂的数量减少，死亡数明显减少。两周后鱼群基本恢复健康，采食量恢复至正常水平，鱼群未出现疑似越冬综合征的症状。