鲟感染海豚链球菌组织病理学研究

文/王静波 徐立蒲 刘建男 张文 吕晓楠 王小亮 曹欢 王姝

鲟鱼是一种经济价值很高的大型冷水经济鱼类。近年来，鲟鱼养殖业发展迅速，各种病害尤其是细菌性疾病日益严重，制约了鲟鱼养殖业的健康发展。链球菌是一种条件性人畜共患病病原菌，可引起局部组织蜂窝织炎、心内膜炎及化脓性脑膜炎等。其中，海豚链球菌可感染多种海淡水鱼类，引起鱼类的脑膜炎和败血症。目前已有多例海豚链球菌感染西伯利亚鲟、施氏鲟和杂交鲟等引起暴发性疾病的报道，海豚链球菌已成为鲟鱼养殖业的重要威胁。为此，有必要开展鲟鱼感染海豚链球菌后的病理损伤特征研究，探索海豚链球菌对鲟鱼的致病机制，为鲟鱼链球菌病的准确诊断和防治措施研究奠定基础。

一、病原菌的鉴定与组织病理切片制作

（一）患病鲟

采自河北保定某鲟鱼养殖场。

（二）病原分离与鉴定

取症状典型的患病鲟，无菌操作从肝、脾和肾划线分离，于脑心浸液琼脂（BHIA）平板和哥伦比亚血琼脂培养基，于28℃恒温培养箱培养20h。

病原菌鉴定采用API鉴定系统和16S rDNA分子生物学方法。

（三）主要试剂和设备

脑心浸液琼脂培养基、革兰氏染色试剂盒、哥伦比亚血琼脂培养基、API 20 STREP鉴定试剂条、UNIQ-10柱式细菌基因组抽提试剂盒、PCR相关试剂；试验试剂酸性分化液、二甲苯、无水乙醇、切片石蜡、树胶、苏木精、伊红染液等；全自动脱水机、包埋机、冷冻机、切片机、烘片机。

（四）组织病理切片制作与观察

取患病鱼肝、脑、心、鳃、肾、脾和肌肉等组织于10%中性福尔马林中固定。固定组织经酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋和常规石蜡切片，切片厚度为4μm。切片经HE染色，中性树胶封片，用Leica DM4000 LED 观察并拍照记录。

二、主要病理变化

（一）临床症状

患病鱼外观主要症状为口周围、腹部两侧骨板、肛门出血（图1）。剖检见部分试验鱼腹腔中有红色血样腹水；肝脏充血并有出血点（图2）；脾脏肿大；肠道充血发红，肠壁变薄，肠道积液；肾脏明显肿大，出血呈紫黑色或严重糜烂不易剥离。

图1 鱼口周围充血、肿胀

图2 腹腔红色血水、肝脏淤血、脾脏缺血

（二）病原分离鉴定

分离菌在BHIA培养基上28℃培养24h的菌落特征为：白色、圆形、边缘齐整、扁平、直径约0.3mm～0.5mm。在血琼脂平板上28℃培养24h，菌落为圆形，中心白色，周边半透明，形成β溶血环。氧化酶阴性，触酶反应阴性，革兰氏染色阳性，卵圆形，呈链状或双排链状。

采用API 20 STREP 系统和PCR 16S rDNA 基因鉴定为海豚链球菌。

（三）组织病理学变化

组织病理检查发现，试验鲟鱼呈全身性感染的败血症表现，各器官组织都有不同程度病变，尤以脾脏和肾脏的病理损伤最为严重。各器官组织的具体病理损伤情况如下。

脑：脑膜疏松，水肿增厚，并伴有毛细血管扩张淤血，有大量色素沉积（图3A）；感染后期脑基质疏松、水肿呈海绵状，神经元细胞肿胀，出现局灶性的液化性坏死（图3B）。

图3 杂交鲟海豚链球菌感染的组织病理学变化

肝：肝血窦扩张、淤血，肝静脉淤血或缺血（图3C）；肝细胞肿胀，弥漫性空泡变性，部分区域发生液化性坏死，感染后期有中性粒细胞和巨噬细胞浸润（图3D）。

脾：脾脏被膜水肿增厚甚至与实质剥离；脾组织严重淤血、出血，脾实质淋巴细胞被红细胞取代，呈出血性坏死性脾炎。脾红髓与白髓边界模糊不清，结构不清；部分区域白髓坏死，淋巴细胞减少，组织疏松（图3E）。感染后期脾被膜成片脱落，脾实质组织严重缺血，淋巴细胞大量减少、嗜酸性粒细胞显著增多，部分区域出现严重的液化性坏死（图3F）。

肾：整个肾脏组织缺血，肾间组织中红细胞和淋巴细胞减少，部分区域出现液化性坏死导致肾间质疏松；肾间组织中嗜酸性粒细胞异常增多（图3G）。肾小管上皮细胞肿胀、变性，甚至坏死脱落，肾小管上皮细胞透明滴状变，严重时肾小管上皮细胞和肾小管管腔内可见大量均质红染的蛋白质颗粒（图3H）。

鳃：鳃组织病变较轻微，主要表现为鳃小片上皮细胞肿胀，毛细血管扩张，充血。

骨骼肌：肌肉组织病变较轻微，仅见肌纤维轻微变性肿胀。

三、结果与分析

在致病性链球菌中，海豚链球菌宿主范围广泛，可感染海淡水鱼类和其他动物，是危害性强的人畜共患病病原和水产病原。目前，鲟鱼海豚链球菌感染的病例日益增多，海豚链球菌已成为养殖鲟鱼中危害大的细菌性病原之一。本研究发现，在患病鲟各器官组织中，脾脏和肾脏损伤最为严重，为主要的靶器官和组织。脾脏实质组织坏死、严重出血，淋巴细胞减少，呈出血性坏死性脾炎；肾脏则主要表现为肾间组织坏死，肾小管上皮细胞透明滴状变，嗜酸性粒细胞增多；肝脏和脑组织可见液化性坏死灶，肝脏中有炎症细胞浸润。海豚链球菌感染不同宿主时会表现出不同症状，如引起海豚的多灶性皮下脓肿、人的蜂窝织炎、关节炎等，鱼类则多表现为全眼球炎、脑膜炎和败血症。本研究发现，鲟鱼海豚链球菌病的临床症状与人、海豚等动物有较大差异，与其他鱼类感染海豚链球菌较为相似，但未见到明显的全眼球炎症状，这可能主要与宿主的种属特异性有关。

鱼类的脾脏和肾脏是重要的免疫器官。脾脏是机体免疫应答反应的主要场所，同时也具有造血功能，是红细胞、各种粒细胞产生、储存和成熟的主要场所。鱼类的肾脏也具有造血功能，肾间组织中含有大量的免疫细胞，可以不依赖抗原刺激而产生相应的免疫细胞，是抵御外界病原入侵的直接防线。研究表明，海豚链球菌具有多个重要毒力基因，如cpsD（编码荚膜多糖，能协助其逃避宿主细胞的清除作用）、simA（编码M样蛋白，能够保护细菌免受巨噬细胞的吞噬，使免疫球蛋白失去免疫活性）和sagA（编码溶血素，能够破坏正常细胞的细胞膜，使宿主红细胞发生溶血），这些毒力基因在细菌入侵、免疫逃避和体内增殖中发挥重要作用。感染海豚链球菌后，鲟鱼脾脏和肾脏的严重病变提示海豚链球菌具有很强的毒力，可以突破脾脏和肾脏的免疫防御系统。脾脏和肾脏的损伤又进一步降低了鲟鱼的防御能力，为细菌进一步大量增殖、形成全身感染、引发多组织器官损伤和败血症创造了条件。

许多报道表明，海豚链球菌可突破宿主的血脑屏障，引起鱼类等多种动物的化脓性脑膜炎。本研究中患病鲟脑膜水肿增厚，有大量色素沉积，脑基质发生局灶性的液化性坏死，表明海豚链球菌可突破鲟的血脑屏障，引起脑膜炎。同时，在患病鲟脑组织中并未发现化脓性炎症的标志——中性粒细胞的存在，这可能与感染浓度较大，病程较短有关，即细菌虽然突破了鲟的血脑屏障，但尚未在脑组织内大量增殖，也未来得及引起脑组织内中性粒细胞的大量浸润以形成明显的化脓病灶。此外，患病鲟肝细胞肿胀、空泡变性，部分区域发生液化性坏死并伴有中性粒细胞和巨噬细胞浸润，进一步证实海豚链球菌可引起鲟鱼多器官损伤，以及化脓性炎症。本研究还发现，感染海豚链球菌后，鲟肝脏和肾脏中嗜酸性粒细胞显著增多，这可能与鱼体清除病原、抗感染有关。嗜酸性粒细胞是动物机体重要的免疫防御细胞，在抗细菌、寄生虫和变态反应中发挥重要作用。脾脏和肾脏组织中嗜酸性粒细胞大量增殖，在杀伤细菌的同时，也会进一步促进炎症进展，损伤组织并最终引起多器官损伤。