鲫鱼水霉病病原的分离培养

刘云鹏 程子骞 贾港 徐孟杰

(河北农业大学，河北沧州 061100)

鲫鱼是我国重要的大宗淡水养殖品种之一，在我国大部分地区都有大规模养殖，主要集中在东部、中部和南部地区，在我国淡水养殖业中具有重要地位。长期以来，人们在鱼类水霉病的防治 研究中开展了大量的工作取得了许多成就。20世纪60年代，我国学者曾将水霉 (Proletarian)划入藻状菌纲、水霉目、水霉科。在鲫鱼养殖过程中，感染水霉病的概率相当高，水霉病是最常见的病害之一。

1 实验材料及方法

1.1 实验材料

100%乙醇,感染水霉病的鲫鱼,纱布,脱脂棉,土豆,琼脂,葡萄糖。

1.2 实验仪器及设备

玻璃棒，恒温培养箱，镊子,解剖剪，研砵，显微镜，接种针，酒精灯，电炉,1000 mL烧杯，1000 mL锥形瓶，试管15个，培养皿，高压灭菌锅，超净工作台，载玻片,盖玻片。

1.3 实验所需试液的配制

1.3.1 马铃薯琼脂培养基的配制

将马铃薯洗净、去皮，用电子天平称取200g，均匀切碎，加入到1000 mL无菌水中煮沸，沸腾30 min，再分别加入15g葡萄糖和20g琼脂，搅拌使其充分溶解，纱布过滤入锥形瓶，使用脱脂棉和牛皮纸封口备用。

1.3.2 75%酒精溶液的配制

用无水乙醇与水比例为3∶1配制酒精溶液。

1.4 实验操作

1.4.1配制马铃薯琼脂培养基，75%酒精溶液待用

1.4.2实验材料及用具的消毒

准备75%酒精，将病鱼全面消毒，之后使用无菌水冲洗干净。在干净的培养皿中放一层纱布，并用少量无菌水浸湿，把洗好后的病鱼放在纱布上，盖好后室温保湿1～2h。

将试管用脱脂棉塞好，用牛皮纸封口、包好，将镊子、解剖剪、接种针培养皿等实验器材用牛皮纸包扎好，将其与培养基移入高压灭菌锅中，运行30min。

1.4.3水霉菌的培养

(1)马铃薯琼脂培养基斜面的制备。灭菌后马铃薯琼脂培养基冷却至45℃，在无菌条件下将培养基倒入试管中，每支试管倒1/3左右，之后用脱脂棉塞好试管摆成斜面，冷却凝固后贮存备用。

(2)接种。在超净工作台内将解剖剪和接种针放在酒精灯火焰上烧烤消毒，取5个提前做好的马铃薯琼脂培养基斜面，分别标记1、2、3、4、5号，待解剖剪和接种针冷却后，用解剖剪剪下少量病鱼身上的菌丝，之后用接种针在无菌条件下送到5个培养基斜面上，之后用脱脂棉塞好试管。

(3)恒温培养。将5个试管放到恒温培养箱里面，设定温度为25℃，培养5天。

(4)镜检。培养5天后，取出5个试管，观察菌落生长情况，并用消毒后的镊子在每个试管内各取少量菌丝，做成装片，在显微镜下观察菌丝及动孢子囊的形态结构(图1)，之后取孢子囊数量最多的2号试管备用。

图1 菌丝及动孢子囊的形态结构

(5)研磨和离心。用镊子从2号试管内取出适量菌丝，放入研砵里研磨，破开孢子囊；之后加适量无菌水一起放入离心管内，离心20 min，静置备用。

(6)稀释分离。准备五支灭菌试管依次编号1～5，分别装入9 mL无菌水，用1 mL灭菌吸管，严格无菌操作，从静置后的离心管内分别吸取1 mL上清液注入1～5号管中，摇匀。

(7)提纯培养。从试管中各吸取1 mL悬浮液，将其分别注入到灭菌培养皿中，再加入马铃薯培养基15 mL，充分摇匀后静置，使之冷凝;然后倒置于25℃恒温箱中培养3 d。之后从中挑取单个菌落，接种于斜面上，放入恒温箱中培养5 d。

(8)确定种类。观察菌丝形态及动孢子囊特征确定其属，观察有性生殖器官确定其具体种类。

2 结果

提纯培养的菌丝如图2所示。

图2 显微镜下提纯培养的菌丝

3 分析讨论

霉菌的菌丝较为粗长，菌落相对较大，部分霉菌菌丝呈蔓延式生长，可在整个培养基斜面上观察到其菌落，部分种生长具有一定的局限性，直径1～2 cm及以下，生长区域较小。5放线菌比较霉菌菌落质地通常较为疏松，表面干燥，不透明，显现为蛛网状或绒毛状。霉菌菌落紧密连接在培养基上，不容易挑取；菌落正反面的色彩、边沿与中心的色彩基本不一致。

水霉的菌丝呈管形，内菌丝较为发达，表现为纤细而分支繁多；外菌丝中等粗壮，无分隔[3]。根据图2判断，鲫鱼水霉病病原为水霉目水霉科中的水霉属(ProletarianC.G.Gees)。