锦鲤维氏气单胞菌的分离鉴定

王灿良，任显锋，陈传刚，韦良震，王飞翔，王雪鹏

(1.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018；2.泰安市水产研究所，山东 泰安 271411；3.曲阜渔丰现代农业发展有限公司，山东 曲阜 273100；4.济宁南阳湖农业发展有限公司，山东 济宁 272100)

锦鲤(Cyprinus carpio)在动物分类系统上属于鲤科(Cyprinidae)，在我国属于知名度较高的观赏鱼种类，有“水中活宝石”“会游泳的艺术品”等美誉，具有较高的经济价值(许品章，2004)。近年来，随着人们对观赏鱼需求量逐渐增大，锦鲤养殖集约化程度越来越高，随之而来的锦鲤病害给锦鲤产业的发展造成了阻碍(宋东蓥等，2015)。

为探明造成2021年山东省济宁市某锦鲤养殖场锦鲤暴发性死亡的致病菌，本研究对采集的锦鲤发病样本进行了细菌分离、质谱分析和分子鉴定、回归感染、药物敏感性等，为锦鲤养殖中病害防控提供了科学依据。

一、材料与方法

1.材料

发病锦鲤和用于回归感染试验的健康锦鲤均来自济宁某锦鲤养殖场。发病锦鲤体表有鳞片脱落、出血斑等病变现象，鳃部颜色淡红。

2.菌株分离、纯化与病理切片制备

无菌操作法在病鱼肝胰脏、脾、肾脏取菌，划线于LB琼脂培养基上，30℃温箱培养24小时，再次划线LB琼脂培养基两次得到纯培养菌株，保存备用。取濒死发病鱼内脏团，按常规方法制作石蜡切片：4%甲醛溶液4℃固定3天，经过各级乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，每尾鱼各制备10张，苏木素－伊红染色，贴片，固封(王雪鹏等，2011)。用显微镜观察，并完成图像捕获和处理。

3.分子鉴定

利用本实验室保存的细菌16S r DNA通用引物(上游引物序列为5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；下游引物序列为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应条件为95℃5分钟；95℃30秒、52℃40秒、72℃1分钟，30个循环；72℃5分钟。所得产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

4.质谱分析

取上述分离、纯化的优势菌标记好，涂布于色谱柱上，而后滴加2微升甲酸、2微升基质溶液，在超净台内自然风干后，扫描色谱柱条码录入信息后打开软件进行质谱测定(Sascha S等，2017)。

5.菌液浓度测定

为方便计算菌液细菌含量以及确定回归实验接种细菌数量，计算半数致死量等。取吸光度OD(600纳米)值为2.0时的菌液，10倍比吸收稀释，设计了两组平行平板组A1、A2、A3、B1、B2、B3，分别取稀释了107、108、109倍的菌，100微升涂平板A1、A2、A3、B1、B2、B3；经20小时、30℃恒温培养后，取出计算单菌落，平板涂菌计数，确定吸光度与细菌数的关系。

6.药敏试验

利用纸片扩散法进行本次药敏试验。将上述稀释OD(600纳米)值为2.0的菌液100微升涂布于LB琼脂培养基上，贴上药敏纸片，共14种药物，30℃倒置培养20小时后测量抑菌圈直径。

7.致病性与回归感染试验

为探究该分离菌的致病性，笔者准备了一批体质健康、体重在50～200克的锦鲤，事先在控温水循环水箱中静养5天，静养期间保持温度28℃左右且不喂饲料。5天后，挑选30尾体重在(100±10)克的锦鲤进行本次试验，试验设5个试验组与1个对照组，每组各5尾。采用上述原液(标记为W0)、稀释10倍(标记为W1)、100倍(标记为W2)、1000倍(标记为W3)、10000倍(标记为W4)和PBS溶液(阴性对照，标记为W5)进行腹腔注射感染。每尾健康锦鲤注射0.1毫升。水温为28℃左右，正常饲养。每天观察、记录鱼的发病症状、死亡数量等，连续观察1周。对上述人工回归感染出现明显症状的病鱼再次进行菌株分离后进行质谱分析和分子鉴定，并取濒死锦鲤肝脏、脾脏、肾脏做病理观察。

二、结果

1.细菌分离、纯化

发病鱼肝胰脏、脾脏、肾脏充血发红、出血(图1)。从内脏各器官所分菌株菌落特征较为一致，得到一株菌落呈乳白色、圆点状、边缘平滑的优势菌(图2)，该菌革兰氏染色为阴性(图3)。病理组织学检查以肝脏水肿变性，肝细胞萎缩、坏死，脾脏和肾脏充血、水肿等病变为主(图4～图6)。

图1 病死鱼剖检

图2 菌株分离纯化

图3 纯化菌株革兰氏染色

图4 剖检鱼肝脏切片

图5 剖检鱼脾脏切片

图6 剖检鱼肾脏切片

2.细菌鉴定

所扩增的PCR产物长度约为1500bp(图7)，对琼脂糖电泳为1500bp的条带进行测序，得到16SrDNA序列。该序列经BLAST对比，结果与维氏气单胞菌序列相似性达99.93%以上，与其他维氏气单胞菌的距离比例(系统发育树)见图8。质谱分析结果进一步证实，该菌为维氏气单胞菌，命名为Aeromonasveronii-1。

图7 PCR产物电泳结果

图8 分离菌株系统发育树

3.药敏试验

药敏试验结果显示，四环素类、头孢类、β-内酰胺类抗生素在本次药敏试验中展现了极好的抗菌效果，磺胺类、氨基糖苷类抗革兰氏阴性菌抗生素亦有较好的疗效，而抗革兰氏阳性菌的青霉素类则基本没效果，详见表1。

表1 分离菌株药敏试验结果

4.OD值为2.0时菌液浓度测定、LD50测定及回归感染

当OD(600纳米)值为2.0时，测定该分离株维氏气单胞菌的浓度为1.159×1011CFU/毫升。人工感染健康锦鲤后，不同接种浓度呈现不同的死亡情况，W0、W1、W2、W3、W4、W5组死亡数分别为4、5、3、2、1、0尾。根据Reed-Muench法计算，该菌株的LD50测定为5.383×107CFU/尾。人工回归感染病死鱼只在内脏中再次分离鉴定出了维氏气单胞菌。

三、讨论

近年来，细菌、病毒类疾病给锦鲤养殖业带来较大冲击，其中嗜水气单胞菌、黄杆菌、锦鲤疱疹病毒、车轮虫、小瓜虫等较为常见。目前，细菌鉴定的最经典方法是生化鉴定，但存在工作量大、耗时长、敏感度低等缺点。随着分子生物学和分子遗传学的飞速发展，16SrRNA基因检测技术因其快速简便、特异性较高等优点，被广泛用于细菌的种属鉴定，但也存在对亲缘关系较近的细菌鉴别率不高等缺点。近年来，随着质谱检测技术(MALDI-TOFMS)的不断完善和发展，该技术已经成功应用于微生物的鉴定。MALDI-TOFMS大大缩短了细菌鉴定的时间，而且成本也较常规鉴定方法低，被广泛应用。本研究结合分子遗传学和质谱技术，两者相互辅证、互为补充，使鉴定结果更为准确可靠。

本试验结果与杨求华等(2012)、高金伟等(2016)的结果不一致。但是，本试验所用的国标药物氟苯尼考和恩诺沙星具有良好的抗菌效果，可在实际生产中应用。