一株霍乱弧菌的分离鉴定和治疗药物筛选

沈 飞，孙瑜翀，窦梓韫，吕利群

(上海海洋大学国家水生动物病原库，上海 201306)

2020年8月，佛山市杏坛镇一养殖场出现太阳鱼暴发性死亡。5月开始发病，濒死鱼可见体表轻微发红，死鱼全身发红，解剖可见内脏出血发红，当地人称之为“红身病”。该病发展迅速，第1天死鱼一二十尾，第2天达上百尾，第3天达三五百尾，呈翻倍增多，控制不及时日死亡量可达几千尾，死亡率约70%。为查明病因，本实验室通过生理生化指标、分子生物学技术和人工感染实验确定了一株优势株，并进行抗生素和消毒剂筛选，为该病的临床诊断和药物防治提供参考。

一、材料和方法

1.实验材料

笔者将具有典型红身症状的患病个体作为研究材料，记录病鱼的体征和症状，解剖以观察内脏的病理变化。健康太阳鱼也来自该养殖场，体质量50～80克，暂养1周后用于攻毒实验。

LB琼脂、MH琼脂和革兰氏染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；HBI霍乱弧菌生化鉴定条(SN)、TCBS琼脂购自青岛高科园海博生物技术有限公司；基因组DNA提取试剂盒，2×TaqPCR MasterMix(不含染料)购自天根生化科技(北京)有限公司；水产消毒剂产品购自山西争跃药业有限公司；PCR引物合成及产物测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.病原菌分离鉴定

取濒死的有明显红身症状的太阳鱼，无菌操作下用75%酒精棉球擦拭鱼体，解剖并取其肝、脾、肾组织划线接种于LB琼脂培养基，30℃下培养24小时后挑取单菌落纯培养。将分离纯化后的单菌落接种于TCBS培养基，30℃下培养24小时后进行菌落形态观察。参照《进出口食品中霍乱弧菌检验方法》(SN/T1022-2010)，按试剂盒说明书进行生理生化鉴定。

用天根细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA，用16SrDNA通用引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT)和霍乱弧菌pntA特异性引物(F：CAGTAAAGAAACGACCAAACTC；R：TGCCAGTTTCGATGATGCCG)进行PCR鉴定，将预期大小的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

3.药敏分析和消毒剂筛选

采用药敏纸片法筛选敏感抗生素，采用二倍稀释法测定消毒剂对菌的最小杀菌浓度和最小抑菌浓度。消毒剂浓度为2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、0毫克/升。

二、结果

1.病理特征及菌落特性

病鱼最明显的外部特征是体表发红(图1A)，解剖后发现肝脏有出血(图1B)。分离株命名为SF01，在TCBS琼脂培养基中菌落为黄色(图1C)。

图1 病鱼临床体征及菌落形态

2.生理生化鉴定

生化鉴定结果(表1)显示，SF01氧化酶阳性，能利用蔗糖和甘露糖分解鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶，与霍乱弧菌的生理生化指标基本符合。

表1 SF01生理生化特征

3.16SrDNA和pntA检测结果及系统进化树构建

测序与系统进化树结果显示，SF01与V.choleraeNR.044853、V.choleraeNR.115936聚为一枝，具有较近的亲缘关系。基于pntA设计的霍乱弧菌特异性引物扩增出338bp的产物，综合其菌落形态，生理生化特征可判定分离株为霍乱弧菌。

4.药物敏感分析

药敏分析结果(表2)表明，分离株SF01对恩诺沙星、卡那霉素、头孢哌酮舒巴坦、强力霉素、磺胺复合物、氟苯尼考、利福平、氧氟沙星、磷霉素和环丙沙星极敏感，对阿奇霉素、头孢呋新钠、诺氟沙星、庆大霉素、链霉素、新霉素和妥布霉素高度敏感，对氨苄西林中敏，对新诺明和林可霉素表现为耐药。通过二倍稀释法测量消毒剂对分离菌SF01的最小抑菌浓度(MIC)，并挑选效果较好的消毒剂杀毒先锋、草鲫五病灵、草鱼乌头黑病灵、菌迪、暴血安、鱼用暴血止和菌血立停测量最小杀菌浓度(MBC)，结果见表3。由表3可知，消毒剂菌迪、鱼用暴血安和暴血止等对分离菌的消毒效果最好，聚维酮碘效果较差。

表2 SF01药敏试验

表3 二倍稀释法测定的MIC、MBC

三、小结

养殖场采用氟苯尼考内服，鱼的日死亡量控制在100尾以下，直至无病鱼出现，之后每月使用1次对分离株效果较好的消毒剂进行消毒，可以预防霍乱弧菌的暴发。