姜黄素联合乙二胺四乙酸对荧光假单胞菌的光动力灭活作用
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)属于假单胞菌属,广泛分布于自然界中,在4 ℃条件下能快速生长繁殖,是果蔬、乳、肉等食品中一种常见的嗜冷性腐败菌。它能够产生极耐热的蛋白酶和脂肪酶,这些酶即使在高温下也难以灭活,在食品贮藏过程中严重影响食品的风味、口感、组织状态等,并能在食品、食品加工设备及包装材料等表面形成生物膜,对食品持续进行污染,严重危害食品质量与安全。
河北科技大学食品与生物学院的王 洋、赵瑜玲、韩俊华*等探究以姜黄素为光敏剂的PDI技术对果蔬、乳品及肉品中的优势嗜冷菌——荧光假单胞菌的灭活效果;分析乙二胺四乙酸(EDTA)对姜黄素介导PDI的协同增效作用;采用自行研制的小型光动力设备进行新鲜猪肉的PDI处理,初步分析自制设备的保鲜效果,从而为姜黄素介导的PDI在食品领域中的应用提供理论参考和技术支持。
1、PDI对荧光假单胞菌的灭活作用
姜黄素浓度对PDI作用的影响
姜黄素浓度对荧光假单胞菌的PDI作用的影响如图1所示。随着姜黄素浓度的增加,荧光假单胞菌的菌落数明显降低。当姜黄素浓度为5 μmol/L时,与对照组相比,荧光假单胞菌菌落数对数值减小1.84(lg(CFU/mL))(P<0.05);随着姜黄素浓度的增大,对荧光假单胞菌的PDI效果也随之增强,当姜黄素浓度增加至75 μmol/L时,PDI效果达到最大,荧光假单胞菌菌落数对数值减小7.46(lg(CFU/mL)),灭活效果显著强于其他组(P<0.05)。姜黄素浓度为100 μmol/L时,对荧光假单胞菌的灭活效果不再增强,反而略有降低。
光照时间对PDI作用的影响
光照时间对荧光假单胞菌的PDI作用的影响如图2所示。光照时间对荧光假单胞菌的PDI效果影响显著,且呈现出随光照时间延长先增强后减弱的趋势。光照时间为20 min时,光动力杀菌效果达到最佳,选择此条件进行后续实验。与对照组相比,荧光假单胞菌菌落数对数值显著减小6.40(lg(CFU/mL))(P<0.05)。随着光照时间的继续延长,灭活效果反而减弱。
EDTA质量分数对PDI作用的影响
如图3所示,EDTA对PDI的协同增效作用随着其质量分数的增加呈先增强后减弱的趋势。与对照组相比,当EDTA质量分数分别为0.1%、0.3%时,荧光假单胞菌菌落数对数值分别显著降低了0.37、0.91(lg(CFU/mL))(P<0.05);当EDTA质量分数增加至0.5%时,PDI协同促进效果最佳,荧光假单胞菌菌落数对数值显著下降2.29(lg(CFU/mL))(P<0.05);之后随着EDTA质量分数的增加,其对PDI的协同效果反而逐渐减弱。
2、荧光假单胞菌生物膜的形成
图4A~H分别为培养0、6、12、24、36、48、60、72 h后的荧光假单胞菌生物膜经结晶紫染色后的显微图片。图4A无生物膜形成;图4B、C的荧光假单胞菌稀疏分散,随着培养时间的延长,菌体分布逐渐密集;图4D的菌体数量明显增多,菌体之间相互聚集;培养至60 h时,生物膜已经相对成熟,菌体之间更加密集(图4G);培养至72 h,荧光假单胞菌已经将盖玻片完全覆盖(图4H)。
3、姜黄素介导的PDI对荧光假单胞菌生物膜的破坏效果
对玻璃表面荧光假单胞菌生物膜的破坏效果
姜黄素介导的PDI对玻璃表面荧光假单胞菌生物膜的破坏效果如表1所示。与空白组相比,光照条件下的姜黄素对荧光假单胞菌生物膜有显著的破坏效果,菌落数对数值减小3.44(lg(CFU/mL)),加入EDTA后菌落数对数值减小4.57(lg(CFU/mL)),EDTA显著提高了姜黄素的PDI作用(P<0.05)。而无光照条件下的姜黄素对荧光假单胞菌生物膜的破坏作用有限,加入EDTA溶液后,灭活效果仍未得到改善。
对ABS板表面荧光假单胞菌生物膜的破坏效果
由表2可知,姜黄素介导的PDI处理使其表面生物膜菌落数对数值下降4.42(lg(CFU/mL));加入0.5% EDTA溶液后,菌落数对数值减小约6.60(lg(CFU/mL)),显著提高了PDI效果(P<0.05)。
4、PDI处理对新鲜猪肉的保鲜效果
荧光假单胞菌菌落数变化
不同猪肉4 ℃贮藏期间荧光假单胞菌的菌落数变化如图5所示。贮藏0 d,与空白组相比,PDI处理猪肉表面荧光假单胞菌菌落数对数值减小了2.68(lg(CFU/g)),添加0.5% EDTA后,猪肉表面菌落数对数值减少3.23(lg(CFU/g)),表明PDI处理对新鲜猪肉表面的荧光假单胞菌具有良好的灭活效果,而且EDTA能够进一步提高其灭活效果。随贮藏时间的延长,空白组猪肉表面的荧光假单胞菌快速生长,第3天时菌落数增长至7.90(lg(CFU/g)),而经PDI处理后的猪肉中荧光假单胞菌生长缓慢,第3天时PDI组的菌落数为5.00(lg(CFU/g)),显著低于空白组(P<0.05);第10天时,空白组猪肉的荧光假单胞菌菌落数增长至8.99(lg(CFU/g)),而PDI组的菌落数为6.57(lg(CFU/g)),PDI+EDTA组猪肉中荧光假单胞菌菌落数仅为5.94(lg(CFU/g)),显著低于其他处理组(P<0.05),表明PDI+EDTA处理对新鲜猪肉表面的荧光假单胞菌具有更好的抑菌效果。
质量损失率的变化
如图6所示,在经过PDI处理后的当天,PDI组质量损失率最大,为2.14%;PDI+EDTA组的质量损失率为1.79%。壳聚糖对照组及PDI组猪肉的质量损失率随着贮藏时间的延长逐渐增大。猪肉经一定时间的光照处理后,表面温度出现短暂、轻微的升高,这可能与猪肉质量损失有一定的关系。这也提示本实验所用PDI处理设备需要增加冷却装置或提高光照强度以缩短光照时间。
色泽的变化
光照处理前后不同浓度的姜黄素溶液颜色如图7A所示,光照20 min后,不同浓度的姜黄素溶液颜色均较光照前明显变浅。为了进一步探明不同浓度姜黄素在猪肉上的使用效果,采用色差仪分别测定不同浓度姜黄素PDI处理后猪肉的色泽,并计算ΔE,结果如图7B所示,新鲜猪肉的ΔE与姜黄素浓度总体呈现正相关关系。75 μmol/L的姜黄素溶液处理猪肉经光照后,第0天ΔE为3.03,显著高于对照组(P<0.05),但感官上可以接受。姜黄素浓度越大,ΔE越大。同时,随着新鲜猪肉贮藏时间的延长,ΔE没有呈现出明显的变化规律,且同一浓度姜黄素处理的猪肉无显著性差异(P>0.05)。
pH值的变化
如图8所示,随着贮藏时间的延长,各处理组猪肉的pH值逐渐升高,这主要是由于猪肉中细菌数量的增加其蛋白质和氨基酸发生降解,形成氨和胺类等碱性物质。在10 d的贮藏期内,PDI+EDTA组猪肉pH值从5.87增加至6.17,与空白组及其他处理组相比,pH值增加相对平缓。由此可以看出,PDI+EDTA作用能够减缓猪肉在贮藏过程中的腐败速率,更好地保持猪肉的新鲜程度。
结 论
本研究结合光敏剂姜黄素浓度、光照时间、协同剂EDTA,优化了对荧光假单胞菌PDI作用的最佳条件,明确了姜黄素协同EDTA的PDI作用对荧光假单胞菌生物膜的去除效果。应用实验室自行研制的光动力杀菌装置,尝试分析EDTA联合姜黄素的PDI作用对新鲜猪肉的保鲜效果。结果表明,姜黄素联合EDTA的PDI作用对优势嗜冷性腐败菌-荧光假单胞菌及其生物膜均具有良好的灭活效果,并能显著抑制新鲜猪肉表面的荧光假单胞菌,改善猪肉感官品质,延长猪肉的保鲜期。
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