过硫酸氢钾复合盐粉对水产病原菌的杀灭效果

发表时间:2024/08/06 15:59:07  来源:水产养殖 2024年1期  浏览次数:2353  
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过硫酸氢钾复合盐粉对水产病原菌的杀灭效果

孙文博,章志强,李庆,曹杨洋,张高峰,杨辉*

(1.扬州大学动物科学与技术学院,江苏 扬州 225009;2.江苏永荣生物科技有限公司,江苏 连云港 222062)

细菌性疾病一直是制约水产养殖业发展的重要因素[1],不仅导致水产动物大量死亡,还会引发病毒性疾病暴发,对水产养殖业造成巨大威胁[2]。控制水产养殖环境中病原菌的数量,对于水产动物疫病防控至关重要。目前,水产动物病害防控的关键技术体系包括病原检测、微生态制剂施用、水产消毒剂、中草药和抗生素的应用[3]。其中,化学类消毒剂可以抑制或杀灭水体中的病原微生物,降低水体中病原菌的丰度,在阻止细菌性疾病的传播和暴发方面,发挥着重要作用[4]。由于成本较低且效果显著,化学类消毒剂目前在水产养殖中得到广泛应用。水产养殖中化学类消毒剂的使用缺乏科学指导,滥用消毒剂会给养殖水环境带来危机。因此,研发环境友好型的水产养殖消毒剂,并科学指导其应用,对于水产养殖业的发展,具有重要意义。

过硫酸氢钾复合盐粉(2KHSO5·K2SO4·KHSO4,简称PMS),是一种由单过硫酸氢钾(KHSO5,PMPS)、硫酸氢钾(KHSO4)和硫酸钾(K2SO4)为主,辅以表面活性剂、无机酸和有机酸等组合而成的一种新型的过氧化物类消毒剂。PMS 能够溶于水,分解产物为无害的无机盐,并在水体中产生高活性的自由基和活性氧等物质,通过氧化作用有效杀灭各种病原微生物,具有广谱的杀菌作用、高安全性和环境友好等优点[5]。PMS 还能降解养殖水体中的氨氮,提高溶解氧水平,促进污泥颗粒的分解,从而改善水质和底质[6-7]。目前PMS 已广泛应用于水产养殖、畜牧业、污水处理和医疗环境消毒等领域。然而关于PMS 对水产养殖相关病原细菌的杀灭效果尚不明确,而且不同生产厂家的产品质量也存在差异,使得选择高质量产品变得困难。现选取水产养殖中常见的8 种病原细菌为试验菌株,分析PMS 在不同浓度下的杀菌动力学参数,同时比较了某国产品牌和某进口品牌生产商生产PMS的杀菌效果,为实际生产中的合理使用及后续研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 时间与地点

2023 年4—7 月。试验地位于江苏省扬州大学动物科学与技术学院水产养殖实验室。

1.2 材料

某国产品牌(A 产品)和某进口品牌(B 产品)生产商生产的PMS(以下简称A-PMS、B-PMS)均为50%粉剂(含有50%的PMS)。8 种病原细菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)(ATCC 35622)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)(BNCC186123)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(BNCC133264)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)(BNCC337051)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)(ATCC33787)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(BNCC138541)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)(BNCC354817)和杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)(CCTCC208068),均为商品化的标准菌株。其中维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠埃希氏菌、河流弧菌、杀鱼爱德华氏菌、溶藻弧菌和鳗弧菌使用LB 液体培养基进行培养,副溶血弧菌使用2216E 培养基进行培养。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌培养及抑菌试验

各菌珠经LB 平板或2216E 琼脂培养基活化后,挑选单克隆菌株,接种于200 mL 相应液体培养基中,并将其放置于恒温摇床(28 ℃/37 ℃,180 r/min)中连续培养24 h 以上,6 000 r/min 离心5 min,收集菌体,并用无菌PBS 磷酸盐缓冲液洗涤2~3 次,做成菌悬液待用。将50%A-PMS 粉剂溶解于无菌水中,并分别配置成1,10,50,100 和200 mg/L的浓度。将配置好的PMS 溶液取10 μL,分别加入1 mL稀释后的8 种菌液中,稀释100 倍,使得PMS 的终浓度分别为0,0.01,0.10,0.50,1.00 和2.00 mg/L。对细菌悬液计数,并进行稀释,确保菌悬液中细菌菌落数少于2×104cfu/mL,以避免菌落数太多致无法准确计数。将不同浓度的PMS与菌液摇匀后,室温下静置处理,并分别在0.5,1.0,1.5 和2.0 h 时,取100 μL 混合液涂布在LB或2216E 营养琼脂平板上,倒置放于28 ℃恒温培养箱培养24 h。培养结束后对平板上的菌落进行计数。

1.3.2 A-PMS、B-PMS 杀菌效果比对试验

将A-PMS、B-PMS 粉剂稀释至终浓度为0.5,1.0,10.0 和50.0 mg/L。所选用的菌株与培养处理的方法同1.2,但仅在处理2 h 时进行涂板计数,计算其杀菌效率。

1.3.3 PMS 对降低鲫感染维氏气单胞菌的死亡率试验

为了进一步验证PMS 对养殖水体病原细菌的杀灭作用,分析PMS 对通过人工浸泡感染维氏气单胞菌鲫死亡率的影响。选择的鲫体质量为(0.52±0.18)g,体长(3.44±0.37)cm。试验鱼暂养在5 L 的透明亚克力水槽中,连续曝气,控温在25 ℃,每个水槽中暂养30 尾鲫,共6 个水槽。感染试验分为2 组,分别为对照组和试验组,每组3 个重复。试验组和对照组的养殖水体中均添加过夜培养的维氏气单胞菌,浸泡感染的细菌浓度控制在106~107cfu/mL。试验组每天往水体中添加A-PMS 至2 mg/L,试验持续5 d,统计鲫的累计死亡率。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0 软件作图,试验数据以“平均值±标准差”表示,采用t检验和单因素方差分析组间数据的差异性,试验组与对照组P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 PMS 对不同病原菌的杀灭效果

PMS 对8 种不同病原菌的杀灭效果见表1。由表1 可见,PMS 对常见菌的杀菌效果不具有特异性。在相同处理时间下,PMS 的浓度越高,菌落数量越少,杀菌率越高。在2 mg/L 的浓度下,处理时间超过1.5 h,杀菌率基本可以达到100%。

表1 不同浓度的PMS 2 h 内对各细菌的杀菌率%

2.2 A-PMS、B-PMS 杀菌效果对比

A-PMS、B-PMS 对8 种不同病原菌的杀灭效果见表2。由表2 可见,在高浓度(5.0 mg/L)下,这2 种产品对所选的8 种常见病原菌都表现出良好的杀菌活性,几乎能完全杀灭该浓度下的病原菌。在低浓度(0.5 和1.0 mg/L)下,A-PMS 对维氏气单胞菌(A. veronii)、嗜水气单胞菌(A. hydrophila)、大肠杆菌(E. coli)、河流弧菌(V. fluvialis)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、杀鱼爱德华菌(E. piscicida)和副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)表现出更高效的杀菌活性。这一结果间接证明了不同厂家生产的PMS 产品之间的差异性,A-PMS 则展现出更好的杀菌效果。

表2 不同浓度的2 种品牌产品对细菌的杀菌率%

2.3 PMS 对鲫感染维氏气单胞菌的累计存活率

采用累计生存曲线,统计了A-PMS对鲫感染维氏气单胞菌的累计存活率,结果见图1。由图1 可见,对照组鲫感染细菌后的存活率,显著降低,经过5 d,累计存活率仅为43%;而试验组在水体中使用2 mg/L 的A-PMS 进行消杀,5 d 后的累计存活率为76%。由累计存活率曲线可见,使用A-PMS 处理养殖水体后,能够显著提高鲫感染维氏气单胞菌的累计存活率。

图1 PMS 对鲫感染维氏气单胞菌累计存活率

3 讨论

3.1 PMS 在水产养殖中的强效杀菌机理及影响因素

PMS 具有强大且有效的非氯氧化能力,为应用广泛的畜禽和水产养殖的消毒剂和水质改良剂[8-9]。作为化学类消毒剂,PMS 的杀菌原理主要是利用其强氧化性,在直接与菌体或酶蛋白中的氨基、羧基、巯基等发生反应的过程中损伤细菌细胞结构或抑制代谢功能,从而导致其死亡[10]。研究指出,PMS的消杀活性受养殖水体中有机物浓度、温度和pH值的影响[11]。除了杀灭细菌外,PMS 还能氧化水体中的有机物,因此也会影响对病原细菌的消杀效果。因此,在评估PMS 对病原菌的杀灭活性时,传统的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定方法不适用,需要采用类似于本试验中分析PMS 对不同细菌的杀菌动力学参数的方法[12-13]。尽管本试验中PMS 对不同病原菌的杀灭效率存在一定差异,但随着PMS 浓度的增加和处理时间的延长,2 mg/L 的PMS 处理2 h,已经能够显著杀灭104cfu/mL 的病原细菌,表现出较强的杀菌效果。PMS 的杀菌效果与浓度、处理时间以及初始菌体数量显著相关,但其对不同细菌的杀灭特异性则不明显。有研究[14]指出,10~60 mg/L 的PMS,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等不同病原微生物处理5 min,其杀灭率均>99%。1 250 mg/L 的PMS 对溶血性链球菌和多杀性巴氏杆菌作用2.5 min,杀菌对数值>5[15]。PMS 对黄颡鱼2 种病原菌温和气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌的杀菌浓度分别在31.25 和125.00 mg/L[16]。上述研究表明,PMS 能够显著杀灭病原菌,而杀菌效果差异,主要与PMS 的来源和检测方法有关。而本试验中,排除了培养基中蛋白胨和酵母粉等有机物的干扰,直接展示了PMS 对病原菌的杀灭效果,其结果更能准确反映PMS 对水产病原菌的直接杀灭活性。本试验所选的8 种病原菌均为水产常见致病菌,PMS 对其杀灭效果,为水产养殖病害防控提供了更有效的参考依据。

3.2 PMS 在水产养殖中的效果与安全性

目前市场上销售的PMS 主要以过硫酸氢钾复合盐为主要成分,同时添加了络合剂、增效剂、稳定剂、表面活性剂、氯化钠、有机酸等辅料进行配制。由于不同厂家的配方、生产工艺和原材料等因素的差异,生产出的PMS 产生的效果各不相同,质量良莠不齐[17]。在本试验中,2 种PMS 产品在高浓度下对病原细菌的杀灭效果一致,但在低浓度下,A-PMS 表现出更高的杀菌效率,这也证实了市面上PMS 产品效果的差异性。文献[18]研究指出,1 kg 体质量小鼠,急性经口毒性半数致死量(LD50)>4 207 mg。在对黄颡鱼使用PMS 毒性研究[19]中,PMS 使用的安全浓度为8.5 mg/L。PMS 对养殖动物的毒性研究相对较少。文献[20]研究表明,水体中投加PMS 消毒后,造成的遗传毒性显著低于次氯酸钠消毒,产生的卤代烃和卤代物生成较少,这也表明PMS 用于消毒仍有一定的安全风险。而本试验中,PMS 显著提高了鲫感染维氏气单胞菌后的累计存活率,并未表现出明显的药物毒性,这说明PMS 是一种有效的预防和治疗水产细菌性疾病的药物。

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