河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是一种主要从有毒河豚鱼中提取的强效神经毒素。迄今为止，TTX在其宿主体内的生物合成机制仍未解决。在这里，我们假设TTX的合成依赖于宿主肠道微生物群，包括被忽视的不可培养细菌。在这些研究中，我们收集了5种河豚属河豚鱼的肠道内容物，包括一个疑似杂交种，通过16S rRNA扩增子和宏基因组学方法进行肠道微生物群研究。根据LC-MS/MS检测到的TTX浓度，将其肠道样本分为有毒和无毒两组。细菌多样性研究表明，有毒和无毒物种的肠道微生物群落结构存在显著差异。弧菌和蓝藻集中在肠道细菌共生网络，表明它们在TTX生物合成中的重要性。PICRUSt2宏基因组预测和基因集富集分析的结果为TTX生物合成所需的精氨酸前体提供了新的支持。这是第一个利用16S rRNA扩增子和宏基因组方法分析有毒和无毒河豚鱼肠道微生物群的研究，确定了它们肠道环境中重要的微生物共生模式。我们的数据支持了以精氨酸为前体的肠道细菌共生体在宿主体内合成TTX的提议。

鱼类肠道环境中有一个细菌库，它是维持鱼类代谢稳态的重要功能单元。产TTX的细菌通常从河豚的肠道环境中分离出来。尽管信号触发或食物偏好等固有因素可能决定了TTX的生物合成，但河豚肠道中独特的细菌共生体也至关重要。因此，对河豚等含TTX鱼类肠道菌群的分析和综合研究，对于发现TTX生物合成的关键因子或生物标志物具有重要意义。细菌多样性先前已通过聚合酶链反应方法在含TTX的宿主中进行了研究。然而，只有一小部分肠道细菌被鉴定出来。大多数已报道的产TTX细菌仅限于实验室中可培养的细菌，未培养细菌对TTX生物合成的贡献被低估。

到目前为止，第二代测序已经发展成熟，可以通过16S rRNA扩增子和宏基因组学进行细菌群落研究。利用高通量测序技术，我们利用最新的生物信息学工具在不同种类河豚的肠道环境中进行了细菌谱学研究。据我们所知，这是第一个用NGS方法分析河豚肠道微生物群的研究，它将区分有毒和无毒物种的肠道细菌结构，并确定与TTX生物合成相关的独特细菌共生体。我们的研究还将通过元基因组预测来确定TTX生物合成的潜在前体，并阐明它们与河豚肠道环境中细菌共生体的关系。

结果与讨论

有毒和无毒河豚的毒性和肠道菌群比较

在本研究中，养殖河豚与野生河豚的生活环境相似。暗纹东方鲀的体重和体长均显著大于野生种，说明暗纹东方鲀的食物供给较野生种充足、稳定。暗纹东方鲀中的TTX含量是不可检测的，这与之前的研究一致，即有毒河豚鱼在养殖后会变得无毒。野生但无毒的河豚物种为TTX的起源提供了有价值的线索。在我们的研究中，黄鳍东方鲀和暗纹东方鲀的微生物丰富度显著高于有毒物种。此外，基于UniFrac的PCoA和PERMANOVA试验也表明有毒和无毒河豚肠道微生物群的微生物结构存在显著差异。在生活环境相同的情况下，黄鳍东方鲀和其他野生有毒河豚肠道微生物群的差异可能是由它们的饮食造成的，这可能改变整个鱼类肠道微生物结构。虽然河豚的固有因素可能会影响细菌组成，但最近关于不同鱼类饮食改变草鱼中胆汁酸组成以及肠道细菌组成的研究表明，饮食在形成肠道微生物群方面的重要性。因此，本研究推测黄鳍东方鲀可能与其他野生河豚有不同的食物偏好，最终形成不同的肠道微生物群结构。

图1. LC-MS/MS法测定河豚肝中河豚毒素（TTX）含量。（a）TTX标准品和样品的MRM2（m/z320.00～m/z161.80）色谱图。（b） TTX内容方框图。毒性种间平均TTX含量采用威尔科克森秩和检验进行显著性检验（***p值<0.001；NS：不显著）。STD:标准；TObs: T. obscurus; TXan: T. xanthopterus; TBim: T. bimaculatus; TOce: T. ocellatus; TOceH: hybrid suspected T. ocellatus。

在这项研究中，我们发现所有物种中最主要的门是变形杆菌，这与之前关于T. obscures可培养细菌的研究一致。通过16S rRNA亚基因组研究，扩展了对河豚肠道优势菌的认识。我们发现大量螺旋体、厚壁菌和拟杆菌（图2a）也构成了有毒、无毒、野生捕捞和养殖河豚鱼的肠道微生物群组成。由于分类学数据库的不足，大多数 OTUs的系统发育分类无法准确获得。然而，在ANCOM测试中，在物种水平上分类的许多 OTUs显著分化（图2e）。结果发现，有毒物种中有大量的Aliivibrio fischeri。此外，在有毒物种的肠道环境中也大量发现弧菌属，表明弧菌属和alivibrio属在有毒物种的细菌群落中的作用可能比无毒物种更为重要。最近的研究表明，细菌共生体受到霍乱弧菌VI型分泌系统的不利影响，这可以解释在功能上受弧菌控制的有毒肠道环境中微生物丰富度显著降低的原因。独特的肠道微生物群可能是由有毒河豚物种独特的食物偏好形成的，这可能随后为TTX生物合成创造必要的条件。另一方面，最近的研究表明，在有毒河豚（Chelonodon patoca）中经常检测到扁平扁虱序列，这表明有毒河豚通过捕食扁平扁虱卵来积累TTX。然而，无论是TTX的产生机制，还是扁形虫消化系统中的细菌组成，都没有被研究。平头扁形虫或其他TTX载体如章鱼可能在消化系统中具有类似的TTX生物合成的细菌基调。本研究为有毒和无毒河豚肠道菌群的进一步研究提供了参考。

图2. 河豚肠道微生物结构及多样性。（a） 操作分类单元（OTUs）在门水平上的相对丰度。相对丰度小于1%的门被归入“其他门”。（b） 最新分类水平的前十大OTU相对丰度。前十名以外的相对丰度较低的otu被分配给“其他”。（c） Chao1α多样性箱线图。种间方差分析和毒性组（N=24）与非毒性组（N=18）的韦尔奇T检验进行显著性检验。*p<0.05。（d） 不加权UniFrac原理坐标分析。空心椭圆和实心椭圆分别代表按河豚种类和毒性分组的样本聚类（95%置信度）。PERMANOVA（999次排列）检验其显著性。（e） ANCOM c测试火山图。Log2FC > 0/Log2FC < 0的点代表有毒/无毒河豚肠道微生物群中的OTUs。虚线分隔了显著不同的OTUs（上图）和不显著的OTUs（下图）。TObs: T. obscurus; TXan: T. xanthopterus; TBim: T. bimaculatus; TOce: T. ocellatus; TOceH: hybrid suspected T. ocellatus。

弧菌属和 Calotrichaceae（蓝藻）产TTX的共生体

在这项研究中，发现有毒物种肠道环境中的细菌在ANCOM测试中一致，显示出明显的丰度，而网络集中度显示了细菌群落中的功能重点。例如，布氏瘤胃球菌和Aliivibrio fischeri在毒性组中均表现出明显的丰度（ANCOM检验）和网络中心性，表明它们之间可能存在联系或参与TTX的生物合成。瘤胃球菌在河豚肠道环境中的作用尚不清楚。然而，检测食用非淀粉多糖的Siganus canicallatus肠道中发现的瘤胃球菌种类表明瘤胃球菌种类在鱼肠道纤维素降解中的作用。此外，瘤胃球菌中丰富多样的纤维素降解酶将多糖转化为其他细菌共生体和宿主的营养源，揭示了它们在肠道环境中的关键作用。

图3河豚肠道微生物共生网络分析。（a） OTU级共现网络。显示Spearman-rho阈值>0.8和p值<0.05的共现对。边缘显示节点之间的正（红色）和负（蓝色）关系。每个河豚组的网络中心性被强调。（b） 分支图显示河豚肠道网络中心性的共同树及其相对丰度百分比（%RLA）。用威尔科克森秩和检验（WT）比较了有毒（N=24）和无毒（N=18）河豚的相对丰度（*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001；NS：不显著）。TObs: T. obscurus; TXan: T. xanthopterus; TBim: T. bimaculatus; TOce: T. ocellatus; TOceH: hybrid suspected T. ocellatus。

与R. bromii的发现相似，Aliivibrio fischeri也被发现是有毒河豚肠道环境中的网络中心，与无毒组相比，其丰度显著更高。Aliivibrio fischeri是一种产TTX的细菌，发现于花紋愛潔蟹（Atregatis floridus）。其在有毒河豚内脏中的相对优势直接暗示了其与TTX生物合成的密切关系。此外，代表弧菌种类的浓度主要在有毒河豚中发现（图3b）。其中，V. gigantis、V. renipiscarius的产TTX能力尚不清楚。然而，它们最初是从海洋物种中分离出来的，并被认为在海洋环境中定殖于河豚。次级代谢产物经常出现在由弧菌组成的共生细菌群落中。虽然弧菌是最常见的产TTX细菌属，但没有成功分离出能持续生产TTX的弧菌菌株。关于这一事实，由弧菌组成的共生体或潜在的诱因被怀疑是TTX生物合成的原因。

除了弧菌物种外，在有毒样品的微生物共生网络中发现了属于蓝藻谱系的Calotrichaceae（图3a，b）。很少有研究报道在河豚的肠道环境中存在蓝藻。然而，作为海洋环境的主要栖息生物，蓝藻可以被动地进入河豚的肠道。先前的研究表明蓝藻是霍乱弧菌的宿主。因此，在本研究中，弧菌与蓝藻可能在有毒河豚的肠道环境中形成共生关系。蓝藻是已知的负责石房蛤毒素（STX）生物合成的细菌，其结构与TTX具有相似的胍基。河豚以前被发现同时产生TTX和STX，表明它们的非排他性关系。STX的生物合成是通过蓝藻中大量的基因簇来实现的。在TTX的情况下，编码TTX生物合成的确切基因或基因簇是未知的。弧菌和蓝藻在有毒河豚肠道环境中的显著共存可能决定了TTX的生物合成。然而，TTX和STX在生物合成过程中是否相互关联，如共享相似的前体或中间产物尚不清楚，需要进一步研究。

另一方面，虽然在无毒河豚中也发现了弧菌，但只有一种被定义为网络中心，即弧菌在无毒河豚肠道环境中的作用不如在有毒河豚肠道环境中重要。除了弧菌和蓝藻外，本研究还发现 波罗的海希瓦氏菌和Pseudoalteromonas neustonica 是有毒河豚的网络中心，尽管与无毒组相比，它们的相关性并不显著。在希瓦氏菌属和Pseudoalteromonas属中，分别鉴定出未知种的Nassarius semiplicatus和Nassarius semiplicatus 为TTX产生菌。因此，在本研究中发现的巴尔的沙瓦氏菌和伪交替单胞菌也可能有助于TTX的生物合成。然而，尽管扩增子序列较短，但细菌染色水平的鉴定仍有困难，因此本研究还需要进一步的研究来确定希瓦氏菌属和Pseudoalteromonas属的确切菌株。

形成有毒和无毒河豚肠道微生物群的因素多种多样。河豚肠道内细菌共生体组成的变化可以确定TTX的存在。Moritella sp.、Eionea sp.、 Methylophaga sp.、 Rhodobacter sp.、Desulfovibrio sp.和Calotrichaceae在有毒河豚中的独家发现及其作为网络中心的重要性强烈表明，有毒样品的肠道环境满足了它们作为共生体的生长，这也有利于TTX作为次级代谢物的生物合成。我们的研究确定了肠道细菌共生体的主要组成部分弧菌属和蓝藻。弧菌和蓝藻的体外共培养可以进一步验证共生体中TTX的生物合成。

与TTX生物合成有关的代谢途径

精氨酸被认为是TTX生物合成的前体，作为TTX中胍部分的氨基供体，然而，尚未得到证实。在这项研究中，PICRUSt2基因组预测和GSEA结果预测，与无毒河豚相比，有毒河豚肠道微生物群中的精氨酸生物合成明显更活跃，这支持了先前的建议。谷氨酸的精氨酸生物合成在不同的细菌以及弧菌和蓝藻中有很好的记录。弧菌和蓝藻中精氨酸生物合成的模式是相同的，谷氨酸被催化生成精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸，最后生成精氨酸，在我们的研究中，所有编码催化的基因在有毒河豚的肠道微生物群中显著富集。尽管河豚体内的其他肠道细菌也可能参与精氨酸的生物合成，但弧菌和蓝藻在肠道微生物群共生体中的相同生物合成模式和关键作用至少表明它们参与了有毒河豚肠道环境中的精氨酸生物合成。在弧菌和蓝藻中大量发现的非核糖体肽合成酶（NRPS）被怀疑利用精氨酸结合TTX的胍部分。然而，NRPS的存在及其与TTX生物合成的关系有待进一步研究。

图4. PICRUSt2 KEGG Orthology（KO）预测、区分和基因集富集结果。（a） MA图显示毒性组（N=24）和无毒组（N=18）之间通过ALDEx2算法确定的显著不同KOs。BH校正p值<0.01且效应大小>1（毒性组明显）或效应大小<1（无毒组明显）的KOs被认为是显著不同的。只有效应大小>1和BH调整p值<0.01的KOs用于随后的基因集富集分析。（b） 显著富集KEGG路径条图。基因集富集分析（GSEA）中校正p值<0.05的KEGG通路被认为是显著富集的（富集分数>0：在毒性组富集；<0：在无毒组富集）。（c） 精氨酸生物合成。通过ALDEx2分析，显示了显著上调/下调（红色/蓝色）的KOs和非显著上调/下调（灰色）的KOs。

除了精氨酸生物合成的发现外，霍乱弧菌生物膜形成的途径在有毒河豚鱼肠道环境中被发现显著富集，这进一步强调了弧菌在河豚肠道环境中精氨酸生物合成以及TTX生物合成中的重要性。虽然弧菌的菌株水平并不常见，但弧菌属经常出现在海洋鱼类的肠道环境中。最近的研究表明，抗生素诱导的鱼类肠道细菌丰富度和多样性的减少增加了机会弧菌在肠道环境中的优势。根据我们的研究，发现有毒河豚肠道环境中的微生物丰度显著较低，弧菌集中在细菌共生网络中，相对丰度显著高于无毒肠道环境。结合毒性组霍乱弧菌生物膜形成相关代谢途径的发现，我们怀疑机会性弧菌可能主导了有毒河豚鱼的肠道环境，并可能参与了TTX的生物合成。发现机会弧菌在体外和体内的表达不同，这可以解释弧菌在体外的低TTX检测。然而，特定的未知或未确认的弧菌菌株可能是TTX产生的原因，这有待进一步确认。

(来源： 水生动物健康评估 南湖意)