摘要

受精是一个重要的过程，是生命的起始，可从本质上影响生物体的健康。卵子在受精后变化显著，主要包括卵膜硬化，这个过程复杂并且涉及了细胞和分子方面的变化。本文重点介绍了硬骨鱼鱼卵卵膜硬化的机理。我们认为，卵膜硬化可能分两个步骤进行：(a)金属蛋白酶(alveolin)水解透明带蛋白ZP1的N端脯氨酸-谷氨酰胺(Pro-Gln)区域，(b)谷氨酰胺转移酶(TGase)催化水解的ZP1与ZP3发生分子交联。在不同的物种中，受精后卵膜的硬化具有进化保守性。我们探讨并总结了在哺乳动物和非哺乳动物卵子卵膜硬化过程中涉及与生化功能和分子间相互作用相关的重要因子：包括金属蛋白酶、 TGase、过氧化物酶和其他因素(多糖链、Zinc和Larp6蛋白)。相关数据表明，在体内受精过程中，卵膜硬化对防止多精受精至关重要，同时在体外受精中，卵膜硬化有利于保护发育中的胚胎免受外界机械冲击以及防止细菌感染。本文试图通过进一步阐释受精过程卵膜硬化的机制，希望可以对生物繁殖和水产养殖有帮助。

受精是一个重要的生物学过程，在这个过程中，卵子变化显著，其中最明显的就是卵膜硬化。大多数脊椎动物的卵被卵膜所包围，这个结构主要是母源糖蛋白组成的细胞外基质（EMC）。不同的物种对卵或胚胎的卵膜结构有不同的命名，例如在哺乳动物中被称为透明带（zona pellucida, ZP）、在鸟类中被称为卵周层（perivitelline layer）、在两栖动物中称之为卵黄膜（vitelline envelope）以及在鱼类中称之为绒毛膜（chorion）。

根据先前的研究，在本文中统一用“卵膜（egg envelope）”一词来描述与卵膜密切相关的糖蛋白ECM层。

受精后卵膜的变化对于生殖健康很重要，因为受精是生命的起始。在水生物种中，硬化的卵膜通过提供一种分散和附着的介质来影响胚胎的发育，或者在胎生物种中，硬化的卵膜可保护发育中的胚胎直到孵化。

在许多物种中已报道了可能导致卵膜硬化的生化过程。在哺乳动物中，卵膜硬化可能涉及四个生化过程：（a）ovastacin裂解ZP2；（b）ZP3和其他ZP亚基的去糖基化; （c）通过凝集素使聚糖交联；（d）锌离子与ZP结合。在无尾两栖类的卵中，锌金属蛋白酶在ZP2的N末端结构域的单个残基处进行水解，引起糖蛋白ZP的构象变化，从而导致卵膜变硬。海胆卵膜的交联机制也已有报道，主要包括谷氨酰胺转移酶催化邻近的谷氨酰胺和赖氨酸发生交联，以及过氧化物酶介导的交联，这些过程导致受精后卵膜变化显著。

此外，已有研究表明双翅目昆虫的卵膜在过氧化酶的催化下介导双酪氨酸或三酪氨酸形成交联。虽然关于鱼类硬化酶的相关研究在早期已有总结，但鱼类卵膜硬化机制仍然是受精生物学中的一个有趣的问题。在硬骨鱼类受精过程中，鱼卵卵膜和卵表面发生了显著的生理变化。这些转变包括与卵膜硬化相关的细胞和分子方面的变化：柔软、易碎的卵包膜变为坚韧的结构，从而保护发育中的胚胎免受水生环境危害和病原体的侵害。在硬化的过程受到多种酶的调控，这些酶在复杂的硬化过程中起关键作用。本文关注并综述了近年来鱼类卵膜硬化的细胞和分子机制的研究进展，以加深和拓宽我们对卵膜的认识。

在不同的物种中，受精后卵膜的硬化具有进化保守性，如硬骨鱼、无尾目（蛙)、双翅目动物等非哺乳类物种，以及小鼠、仓鼠、猪等哺乳类物种。在不同的物种中，这一课题的研究已经取得了比较广泛的进展。本文综述了近年来有关哺乳动物和非哺乳动物中卵膜硬化相关影响因素的生化功能和相互作用，包括酶（金属蛋白酶、谷氨酰胺转移酶、过氧化物酶/卵过氧化物酶）和其他因素(多糖物质、锌和Larp6蛋白)，表明卵膜硬化的过程涉及导致细胞和分子组成变化的复杂反应。卵膜硬化是受精和繁殖的重要步骤。了解介导受精的细胞和分子机制将有助于解决人类特发性原因引起的不育或有助于应用在实际生产的养殖业中。

01卵膜

在早期生命阶段，卵膜是一种必要的结构，在多物种间表现出功能多样性，对生物体生殖健康有重要影响。哺乳动物体内受精后，卵膜发生硬化对防止多精受精具有重要作用。在体外受精的硬骨鱼类中，卵受精后的硬化过程中卵膜发生显著变化，这有利于：(1)保持水分或压力；(2)在水环境中保护胚胎；(3)绒毛膜的气体扩散与交换；(4)硬化；(5)阻挡细菌和真菌。在体外发育的生物体中，如大多数鱼类、海胆和无尾目(蛙类)，胚胎的发育环境危险，其卵膜通常比在体内发育的胚胎的卵膜需要更多的功能。

卵膜在物种间表现出显著的结构多样性。透射电子显微镜(TEM)观察到的不同物种卵膜超微结构不同，通常由2-3层构成 (图1)。鸟类的卵膜包含2层，由一层连续的薄膜分隔开, 卵膜内层或卵黄周层由1- 3.5μm厚的纤维网络组成，介导了物种间特异性的精子结合，而外层的厚度有3-8μm，被认为与受精后防止多精入卵有关。鱼类卵膜包含2 -3层，内层为纤维结构，而外层无定形结构，此外，粘性卵受精或激活后外部可能出现粘性层。蝇(双翅目)的卵膜由2层组成：内卵黄层和外绒毛膜层，对防止脱水、阻隔多精受精和抵抗机械压力具有重要作用。两栖类新产出的卵母细胞被体腔膜包围，体腔膜由相互连接的束状结构构成，这种结构通过跨越卵周隙的密集纤维网络与质膜的微绒毛突出物相连，不具有精子结合活性。

 图1.代表性生物卵膜的透射电镜和扫描电镜（TEM和SEM)超微结构分析。(A)哺乳动物卵膜(EE;大鼠,TEM)。(B)昆虫卵膜(En: 绒毛膜内层；Ex:绒毛膜表层；p:柱状物；埃及伊蚊（Aedes aegypti mosquitoes），TEM, 430 x)。(C)两栖动物体腔卵膜(EE；非洲爪蛙（Xenopus laevis）TEM)。(D)鸟类卵膜(OL:外层；CM:连续膜；IL：内层；环颈雉(Phasianus colchicus, TEM)。(E)鱼类卵膜(EE， CA:皮层小泡；斑马鱼(Danio rerio)，TEM)。(F)鱼卵膜(EE；卵孔 (箭头)；鲤鱼(Cyprinus carpio, SEM)。

02ZP蛋白

卵膜由纤维基质组成，成分保守，含有共同的ZP结构域，该结构域在哺乳动物、两栖动物、鸟类和鱼类中结构各有不同。然而一直以来ZP糖蛋白家族的分类较为混乱，最近通过基因复制和假基因化形成了对ZP家族分类的共识：包括了六个亚家族， 分别是ZP1, ZP2/ZPA,ZP3/ZPC,ZP4/ZPB, ZPAX, ZPD 。在哺乳动物和其他脊椎动物中发现ZP1-4。小鼠中的ZP4和狗、猪、猫、牛中的ZP1为假基因。ZPD和ZPAX在所有哺乳动物中均已假基因化或丢失。ZPD只在两栖动物和鸟类中存在，而ZPAX只在鱼类、两栖动物和鸟类中存在。事实上，所有哺乳动物的卵膜都含有ZP2和ZP3蛋白，以及ZP1和ZP4蛋白中的一种或两种。这些发现可能意味着哺乳动物精卵相互作用需要ZP2、ZP3以及ZP1和ZP4中的一个或两个的存在。ZP2和ZP3亚家族在脊椎动物谱系中的普遍存在表明这两个基因在功能上都很重要。在脊椎动物中，ZP基因的数量与卵受精和胚胎发育的环境有关。哺乳动物的一些ZP基因丢失可能是因为它们在基质形成和精卵相互作用中没有发挥重要作用。

不同物种的ZP蛋白合成位点不同。在哺乳动物和两栖类中，ZP蛋白仅由卵母细胞和/或滤泡细胞在卵巢中合成，而在鱼类和鸟类中，ZP蛋白在雌激素的作用下在卵巢和/或肝脏中合成，并通过血液运输到卵巢，并在卵子周围自我组装。在哺乳动物中，糖蛋白持续在卵母细胞膜的外表面沉积，直到斑块间相互连接。同时ZP蛋白前体合成，糖基化修饰，分泌并结合形成具有结构重复的交联丝。早期的ZP糖蛋白被并入到与卵母细胞质膜(PM)融合的分泌囊泡中，并沉积到不断增厚的卵膜的最内层。在大多数硬骨鱼中，可溶性ZP蛋白前体由肝细胞分泌，通过血液运输到卵母细胞，合并到卵膜。ZP前体在卵周隙累积，位于从卵母细胞的质膜延伸到滤泡细胞的长微绒毛基部。当卵母细胞积累卵黄时，卵膜组装进行，螺旋状糖蛋白束形成放射状结构，然后被延伸的微绒毛分开。

ZP结构域是由一个N端亚结构域(ZP- N)和一个C端亚结构域(ZP-C)组成的保守模块，具有类似免疫球蛋白(Ig)的折叠，可能有双重功能。生化数据表明，蛋白质聚合只需要ZP- N，从而将ZP蛋白转化为更高级的结构如原纤维和基质。在硬骨鱼中，卵发生皮层反应并分泌TGase，TGase可能诱导在卵膜富含脯氨酸/谷氨酰胺(Pro/Gln)重复区域的亚基之间交联使卵膜硬化。透射电镜观察斑马鱼卵膜为三层，其中内层的厚度占据75-80%，主要是由ZP3蛋白组装而成。除了含有ZP结构域外，zfZP3还表现出一些独特的特征：包括可能与受精后卵膜硬化有关的富含5个谷氨酰胺串联重复序列的N末端，还有含有两个N -连接型糖基化位点的长C端尾巴。在鱼类中，两个或两个以上的ZP1同源物的存在预示着卵膜上存在更多的交联，这与鱼类卵膜所表现的对机械化学胁迫的抗性一致。鲤鱼ZP1(最初称为ZP2)由一个串联重复结构域和一个非重复结构域组成，重复序列包含13个氨基酸残基，具有高含量的谷氨酰胺。此外，ZP1和其他鲤鱼卵膜物质（FLS、CLS和cystatin)可能是TGase的底物。和浮性卵相比，沉性卵具有结构更复杂、更厚的卵膜，从而保护作用更强，这表明ZP蛋白结构和卵的类型可能影响卵膜的厚度。ZP的组成结构和类型与卵膜硬化密切相关。

03硬骨鱼卵膜的硬化

与哺乳动物相比，硬骨鱼的精子不具有顶体，精子只能通过卵子上的一个特殊的漏斗状结构即微孔，进入卵子。精子进入鱼卵的方式和机制已有很多研究，精子通过微孔进入卵子是根据物种的不同在化学或物理上被引导的。受精后，硬骨鱼鱼卵卵发生皮层反应，皮质小泡的内容物被释放到卵表面，导致卵孔被堵塞(图1)和卵膜蛋白重组，从而形成受精膜。本文主要关注卵膜硬化的作用—这也是受精过程中最重要的方面之一。

在受精过程中，卵膜发生了持续性的化学和物理结构的变化，使卵膜变得坚韧并能抵抗机械、化学和酶的破坏。据报道,一些鱼类的受精卵(如褐鳟(Salmo trutta),大西洋鲑鱼(Salmo salar)和虹鳟（Oncorhynchus mykiss)，和未受精卵相比，能抵抗更多的外界压力(受精后3-7天的褐鳟和大西洋鲑鱼受精卵能抵挡的压力是未受精鱼卵的10-20倍，受精后24 h的虹鳟鱼卵能抵抗的压力是未受精鱼卵100倍左右)。卵膜的修饰在防止多精受精、保护发育中的胚胎免受机械冲击以及保护卵子免受细菌感染等方面发挥着重要作用。此外，许多淡水鱼类，尤其是鲤科鱼类，鱼卵在受精几秒钟后具有粘性，使卵与卵之间、卵与水生植物、石头等基质粘附在一起。卵的粘性在30秒内完全形成，至少持续5分钟，这是由皮层小泡释放的通过卵膜扩散到卵表面的物质介导和控制。然而，鲤科鱼类的卵膜硬化的过程要慢得多，持续时间约为1小时，这表明从皮层小泡释放的的某些物质(糖蛋白)可能参与了卵膜硬化和卵的粘性。

鱼类卵膜硬化是由皮层小泡释放的某些物质引起的。有报道称，卵膜的组成蛋白在硬化过程中发生聚合，并且TGase可能参与了这种聚合。TGase在整个生物系统发育过程中被发现，并通过形成ε（γ-谷氨酰基）赖氨酸键使蛋白质交联。这些共价键通常是不可逆的，并受底物有效性、核苷酸和/或钙离子的调节。已证明在多种鱼类卵膜中发现TGase，如虹鳟、青鳉[82]和鲤鱼。然而，卵膜中TGase直到发生皮层反应时才具有酶活性。这意味着在皮层反应过程中，可能从卵中释放出来的某些物质与TGase活性有关。此外，对青鳉卵膜硬化过程的研究表明，alveolin水解ZP蛋白，引起其与zp3在谷氨酰胺转移酶的作用下发生分子间交联。Alveolin转录本与皮质肺泡成分相关。Alveolin是astacin金属蛋白酶家族成员之一，在卵母细胞中特异性表达。受精后，经过丝氨酸蛋白酶处理后，alveolin以活性形式释放出来，在位于Pro-Gln -X重复区域的天冬氨酸残基的N端处裂解ZP1，引起卵膜硬化。在ZP蛋白的N端存在Pro-Gln-X重复区是许多硬骨鱼类ZP1的一个特殊特征，有时在ZP3中也可以观察到同样的现象。富含Q串联重复序列的ZP蛋白[58,60,86]和具有赖氨酸高含量的cystatin (111个氨基酸中有13个赖氨酸)。因此，这些物质可能是TGase的底物，能够被催化形成γ-谷氨酰基-ε-赖氨酸交联键，最终促进卵膜硬化。

因此，鱼类卵膜硬化的发生可能分为两个步骤: (a)由皮质小泡释放的金属蛋白酶alveolin水解ZP1的N端Pro-Gln区域; (b)在TGase催化下，ZP蛋白（ZP1和ZP3）形成γ-谷氨酰胺-赖氨酸(γ-Gln-ε- lys)交联(图2)。

 图2.鱼卵基本结构示意图(A)以及鱼类卵膜硬化可能涉及的生化过程(B)。鱼卵包膜硬化可分两步进行。受精后，pro-alveolin和未激活的TGase被加工成活性形式并释放到卵周隙。(a) alveolin水解ZP1 N端的Pro-Gln区域，(b) 在TGase催化诱导下与ZP3的分子间交联，形成γ-Gln-ε-Lys异肽桥。EE：卵膜；PM：质膜；PVS：卵周隙；CA:皮层小泡；Yg：卵黄颗粒；Gln:谷氨酰基；Lys:赖氨酸。 

04与卵膜硬化相关的生化和分子因素

受精是后生动物繁殖的必要条件，受精后卵膜硬化是在进化过程中具有保守性。卵膜的分子组成、结构和功能在不同物种中表现出多样性。卵膜硬化在几十年前就被描述过，硬化现象中发生的生化修饰也在多个物种中研究过。越来越清楚的是，卵膜蛋白在受精硬化中的变化与多种酶催化的复杂的反应相关,这些酶包括可限制性水解卵膜的金属蛋白酶以及催化的蛋白交联聚合的TGase或过氧化物酶/ ovoperoxidase。这个过程还受到其他因素的影响,包括多糖链、zinc和Larp6蛋白。以下章节和表1总结了与卵膜硬化相关的生化和分子因素。

4.1金属蛋白酶

皮层小泡释放的金属蛋白酶可以消化一些卵膜蛋白，消化的卵膜蛋白是TGase有效利用的底物，从而导致许多物种的卵膜硬化，这些物种包括青鳉、非洲爪蟾和小鼠。此外，alveolin是astacin金属蛋白酶家族成员之一，在卵子发生过程中合成，并在青鳉鱼卵卵母细胞中特异性表达。Alveolin以糖基化的潜在前体形式包装在皮质颗粒中，受精时通过丝氨酸蛋白酶去除前域而被激活，然后释放。Alveolin 水解ZP1，导致卵膜蛋白重组，在TGase催化作用下ZP蛋白质发横交联反应(图3A)。此外，在硬骨鱼、两栖类和鸟类等一些物种中，astacin样蛋白酶发挥孵化酶功能。在青鳉中，孵化酶(HCE1, HCE2和LCE)水解卵膜蛋白，鱼卵孵化，而alveolin引起卵膜蛋白的重组，导致受精时卵膜变硬。Astacin家族的系统发育分析表明脊椎动物astacin家族成员中alveolin的独特性: 它在系统发育上与孵化酶类群分离，这可能反映了两者之间结构和底物特异性的差异。

虽然根据系统发育分析，ovastacin被认为是哺乳动物中鱼类孵化酶的同源物。研究发现，受精发生时储存在皮层小泡中的ovastacin释放，然后裂解ZP2。ovastacin由基因Astl编码。Alveolin并不是ovastacin的直接同源物，但alveolin和ovastacin在其表达模式和生物学功能上具有相似性(Fig.3A)。在小鼠中，ovastacin的C端结构域仍有一部分附着在质膜上，而ovastacin N端活跃的结构域则被暴露出来，破坏ZP精子配体，引发卵膜硬化。除了在ZP2的裂解中发挥作用外，ovastacin是一种卵母细胞特异性膜金属蛋白酶，称之为SAS1B，它通过结合分泌蛋白介导ZP2裂解并在小鼠受精时ovastacin前体的激活过程中发挥重要作用。

卵膜硬化的机制包括以卵子锌金属蛋白酶限制性水解ZP2蛋白为诱发事件，随后诱导卵膜糖蛋白的整体构象变化。有研究表明只有一小部分的ZP2分子被水解。当大约16%的ZP2被水解时，可以观察到哺乳动物的卵膜完全硬化。水解和硬化的研究表明二者的反应时间不一致：硬化反应发生水解反应之前。这可能表明，在受精过程中还有其他因素的参与，而且水解和硬化是由多种酶催化的复杂的过程。

4.2谷氨酰胺转移酶（TGase）

TGase也被称为蛋白质谷氨酰胺γ谷氨酰胺转移酶，是一种依赖于钙离子的多功能酶，催化谷氨酸残基的γ羧基和赖氨酸的ε氨基之间形成不可逆的共价键。TG家族由8种同工酶组成，在脊椎动物的不同组织中表达，参与凝血、凋亡、皮肤形成和转录调控等过程。TG1缺陷小鼠出生后立即死亡，原因是表皮异常，屏障功能不足，而TG1同源敲除的青鳉突变体存活并发育，没有任何异常。但是在NaCl水溶液中饲养的青鳉突变体幼鱼的存活时间却短于野生型，说明其表皮发育不足，幼鱼无法适应渗透的变化，最终无法生存。

TGase对在一些鱼类的卵膜硬化过程中的蛋白质聚合有重要作用，可能在卵膜富含Pro/Gln的重复区域的亚基之间诱导交联。ZP1含有独特的串联重复序列QQTSQQFQPQKPA/V ，ZP3也表现出高含量的谷氨酰胺残基，而cystatin则表现出高含量的赖氨酸。因此，这些物质可能是TGase的底物，并可催化形成γ-谷酰基-ε-赖氨酸交联，最终导致卵膜硬化(图3B)。值得注意的是，鱼卵ZP1蛋白具有独特的结构域，但不像哺乳动物的ZP1和ZP4,它们具有丰富的谷氨酰胺(Q)和/或脯氨酸(P)并可作为N端延伸。鱼类与哺乳动物ZP结构的差异可能与体外受精向体内受精的转变有关。

海胆卵子具有两种TGases，其中胞外亚型(eTG)是导致受精膜(FE)蛋白交联的主要亚型。这种酶的激活似乎是由于酸从细胞皮层释放到卵细胞表面引起的pH值的快速改变。也许pH值的变化改变了eTG的构象以暴露酶的位点。另外，TGase与其他蛋白的结合可能会因pH的变化而改变。此外，TGase可以调节海胆ECM重塑过程中其他酶的活性。TGase被局部酸化激活，并在受精膜中作用于特定的底物包括ovoperoxidase、rendezvin和SFE9，以及通过直接接合过氧化物酶和调节过氧化氢的产生来调节二酪氨酸交联。

此外，ECM由各种不同的分子组成，包括胶原蛋白、纤维连接蛋白和层粘连蛋白。纤维连接蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白也是TGase的底物。纤维连接蛋白与胶原蛋白或整合素以及微丝相关蛋白相互作用，并进一步通过调节表面tTG招募蛋白酶抑制剂(如cystatin)，这对于细胞基质的相互作用和稳定性以及细胞粘附是必不可少的。因此，这些物质可能是TGase的底物，TGase在它们之间催化形成γ-谷氨酰基-ε-赖氨酸交联。

4.3过氧化物酶/Ovoperoxidase

过氧化物酶存在于大多数物种中，通过生物体内蛋白质的交联参与组织发生，包括海胆、节肢动物，所产生的结构是卵膜组织的必要结构元素。早在1978年，就有过氧化物酶催化酪氨酸交联导致海胆卵膜硬化的报道。进一步的研究发现过氧化物酶是一种皮层颗粒衍生酶，通过催化酪氨酸残基的形成使海胆受精膜硬化(图3C)。

然而，在动物中受精膜的硬化不会作为单一事件发生。Ovoperoxidase与蛋白水解酶协同作用，催化海胆中双酪氨酸残基的形成，或利用海胆胚胎产生的过氧化氢(H2O2)交联受精膜蛋白中的酪氨酸残基。此外，在埃及伊蚊中，过氧化物酶可还原H2O2(作为电子受体)，同时伴有多种底物的一电子和/或两电子氧化，如有机底物、酪氨酸或蛋白质中的酪氨酸残基。H2O2在海胆卵中由海胆双氧化酶1 (Udx1)合成。Udx1是双氧化酶家族的一员，其名称来源于过氧化物酶域和NAD(P)H氧化酶域(一种铁还原酶)。NAD(P)H氧化酶结构域利用来自辅酶NADPH的电子氧化水产生H2O2，也会随着NO的增加而上调，并增强海胆受精膜硬化。这种酶只有在卵子激活后，即皮质颗粒分泌接近完成时才会启动。在这一阶段，过氧化物酶和需要交联来稳定的蛋白质，都在离质膜（PM）很远的地方，即正在组装但未成熟的受精膜内。受精时产生的H2O2主要被过氧化物酶/过氧化物酶利用，选择性地在动物中相邻蛋白和ECM之间建立二酪氨酸交联。

此外，海胆ECM重塑过程中过氧化物酶的活性可能受到TGase的调节。TGase被局部酸化激活，作用于受精膜内的过氧化物酶。过氧化物酶和H2O2的结合最终调节了双酪氨酸交联，这可能表明在卵膜蛋白聚合导致的卵膜硬化过程中，TGase和过氧化物酶/ ovoperoxidase的密切合作发挥了重要作用。

图3.卵膜硬化过程中三种主要酶的生化功能及其相互作用。(A)金属蛋白酶(ovastacin/alveolin)的裂解。丝氨酸蛋白酶激活pro-ovastacin(在哺乳动物中)或pro-alveolin(在青鳉中)，诱导ZP蛋白特异性位点裂解，即水解ZP蛋白N端的Pro-Gln - x重复区，并在谷氨酰胺转移酶的催化诱导下与另一个ZP蛋白发生分子间交联。在ZP的N端阴影区是一个重复区域。(B) γ-谷氨酰基-ε-赖氨酸(γ-Gln- ε-Lys)交联的形成。TGase催化蛋白质交联，在一个蛋白质的去质子赖氨酸(Lys)供体残基(蓝色方块)和另一个蛋白质的受体谷氨酰胺(Gln)残基(绿色方块)之间形成γ-Gln-ε-Lys异肽桥。(C)酪氨酸交联的形成。过氧化物酶/ovoperoxidase以过氧化氢(H2O2)作为电子受体，催化酪氨酸或蛋白质(橙色方块)中的酪氨酸的单电子氧化，导致酪氨酸自由基的形成，酪氨酸自由基的相互作用导致双酪氨酸的形成。 

4.4其他与卵膜硬化有关的因素

其他与受精时卵膜硬化有关的生化因素，主要在哺乳动物中进行了研究，包括寡糖链和锌离子与ZP的结合。ZP对蛋白质水解的易感性可通过作用于其可变的多糖部分而改变，这表明ZP蛋白寡糖链的改变可能参与了小鼠ZP的硬化。此外，最近的研究报道了zinc sparks在ZP硬化防止多精入卵的过程中发挥全新功能。受精卵释放的zinc sparks通过改变ZP复合物的构象，在小鼠ZP硬化过程中加入之前未被认识的锌因子，从而导致多精受精。Zinc sparks可以通过改变ZP1的交联构像改变ZP的架构。Zinc在调节肌动蛋白细丝中的新作用是可能调节卵母细胞成熟和胚胎着床，这可能影响精子和卵子之间的相互作用。因此，zinc的外排是另一个有助于ZP硬化的因素。然而，目前尚不清楚zinc sparks对ZP聚合的影响是由于与基质的非特异性相互作用导致的，还是由一个或多个ZP亚基内的特定结合位点介导所导致的。

此外，最近的一项研究表明，Larp6蛋白是正常卵母细胞发育、卵膜形成和卵激活所必需的蛋白。Larp6是La相关蛋白(Larps)家族的成员，是进化保守的RNA结合蛋白，在真核生物中发挥多种功能。斑马鱼有两个larp基因，larp6α和larp6β基因。Larp6a突变的雌鱼产的鱼卵卵膜不能完全扩张，而且易破。larp6α、larp6β双突变的雌鱼产的鱼卵卵膜比larp6α单突变的缺陷更大。此外，在卵母细胞发育过程中对缺陷卵膜的电子显微镜分析和质谱分析提供了对卵膜蛋白组成的描述，发现与野生型相比，ZP和凝集素型蛋白显著减少，这与表型的缺陷相一致。在Larp6缺失的胚胎中，缺乏扩张的卵膜可能会大大降低胚胎在野外的存活率。

表1.与卵膜硬化相关的主要生化和分子因素

05总结与展望

受精是后生动物繁殖的必要过程。受精后卵膜的变化对生殖健康非常重要，因为它们介导了生命的开始。在这篇综述中，我们主要关注与卵膜变化相关的分子和细胞事件。越来越清楚地认识到，卵膜硬化是一个复杂的现象，包括多个过程，涉及多种酶，它们可以独立地、平行地发生，也可以相互关联。在硬骨鱼中，鱼卵卵膜硬化过程中卵膜蛋白发生变化，是由多种酶催化的复杂反应引起的。金属蛋白酶启动了皮层反应，对卵膜蛋白进行限制性酶解，TGase通过诱导蛋白质之间交联使卵膜硬化，这个过程很可能是通过富含Pro/ Gln的重复区域。因此，我们认为鱼卵膜硬化可以分两步进行。受精后，pro-alveolin和未激活的TGase被加工成活性形式并释放到卵周隙。(a)金属蛋白酶(alveolin)水解ZP1的N端Pro-Gln区域，(b)在TGase催化作用下，与ZP3发生分子间交联，形成γ-Gln-ε- Lys异肽桥。卵膜蛋白交联导致卵膜硬化，可增加抵抗蛋白水解。目前的研究主要集中在实验室模型物种，例如青鳉和斑马鱼。在更广泛的动物类群中(如具有重要商业价值的物种)，解决与受精有关的细胞和分子事件也至关重要。增加对硬骨鱼受精过程的了解可能会对水产养殖有所帮助。

受精后卵膜硬化在物种间表现出保守性。尽管卵膜具有基本的保守结构，但动物卵膜的进化是高度动态的。受精硬化过程中卵膜蛋白的转变与生物化学因素影响的复杂反应密切相关。我们探讨并总结了在哺乳动物和非哺乳动物卵子卵膜硬化过程中涉及与生化功能和分子间相互作用相关的重要因子：包括金属蛋白酶、 TGase、过氧化物酶/ ovoperoxidase，和其他因素(多糖链，Zinc和Larp6蛋白)。卵膜硬化阻止多精入卵在体内受精是至关重要的，以及对保护发育中的胚胎免受机械冲击和抵抗体外受精中的细菌感染也有重要作用，同时对进一步的胚胎发育也有重要的影响。卵膜硬化不完全或过度硬化可能对鱼类或其他物种的繁殖产生重大影响。加深对卵膜硬化和受精的了解后面可能更多依赖于转录组和蛋白质组学的发展，同时强调进一步的分子遗传研究以获得卵膜在进化生物学的严谨认知，这将有助于解决人类特发性原因的不孕或可以在实际生产中应用于养殖业。

本文发表在Biochimie上（Wang YK, Chen F, He J, Xue G, Chen J, Xie P. 2021. Cellular and molecular modification of egg envelope hardening in fertilization. Biochimie 181: 134-144），第一作者是中国科学院水生生物研究所东湖湖泊生态系统试验站的王也可，通讯作者为谢平研究员，是中国科学院战略性先导专项（B类）（XDB31040000）关于季风气候影响下东亚特有鱼类卵型演化研究的一部分内容。