通过染色体位点揭示鲫鱼的同源三倍体起源
发表时间:2020/10/18 15:44:37 作者:覃钦博 ,王娟 ,胡敏 ,黄胜男 刘少军 浏览次数:6992
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在洞庭湖水系统中, 鲫鱼复合体表现出二倍体群体(2n=100, 简称2nCC)和多倍体群体共存的特征. 虽然染色体数目与核型分析已经揭示了这些多倍体鲫鱼分别为三倍体(3n=150)和四倍体(4n=200), 但是一直缺乏直接的遗传证据. 本研究通过对5S rDNA的染色体位点进行分析, 证明了拥有150条染色体的鲫鱼个体(简称3nCC)是三倍体起源(3n=150). 进一步对具有物种特异性的染色体着丝粒位点进行分析, 揭示了3nCC拥有的3套染色体均来源于鲫鱼. 相关研究结果提供了直接的细胞遗传学证据, 证明了鲫鱼复合体群体中拥有150条染色体的鲫鱼个体是同源三倍体起源. 相关研究结果有利于脊椎动物多倍体化和进化研究.
鲫鱼(Carassius auratus)广泛分布于整个欧亚大陆. 虽然在银鲫(Carassius auratus gibelio)群体中早已发现了3种不同倍性个体的存在[1~3], 但是鲫鱼一直被认为是只存在二倍体形式(2n=100)[4,5]. 自20世纪80年代以来, 三倍体鲫鱼(3n=150)和四倍体鲫鱼(4n=200)被相继报道[6]. 因此, 鲫鱼才被发现具有二倍体和多倍体共存的特点. 在鲫鱼复合体群体中[7~9], 二倍体和多倍体鲫鱼的外形特征非常相识, 但是繁殖方式却又明显不同. 二倍体鲫鱼的繁殖方式为两性繁殖, 而多倍体鲫鱼表现出同时具有单性雌核发育和有性繁殖的双重繁殖模式[10~12]. 虽然鲫鱼复合体中的染色体数目与核型多样性说明了多倍体鲫鱼(3n=150和4n=200)是三倍体和四倍体起源[6,13,14], 但是一直缺乏直接的遗传证据. 此外, 多倍体鲫鱼染色体组中的额外组染色体是否来自相同或亲缘关系较近的物种(“同源多倍体”), 或者来自不同物种(“异源多倍体”)并不是很清楚.
5S rDNA和物种特异性着丝粒序列拥有大量拷贝数, 并且表现出明显的物种特异性. 它们在染色体上的位置可以通过相应的分子探针进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)而轻松检测到[15~20]. 在以前的研究中, 通过使用5S rDNA和物种特异性的着丝粒探针进行FISH实验, 证明了通过红鲫(Red crucian carp)(2n=100, AA)(♀)×团头鲂(Megalobrama amblycephala)(2n=48, BB)(♂)杂交获得的异源四倍体鲫鲂(4n=148, AABB)能同时产生具有3套(3n=150, AAA)和2套红鲫染色体的配子(2n=100, AA)[18,19]. 本研究使用这些探针进行FISH实验, 为证明拥有150条染色体的鲫鱼是同源三倍体起源提供了直接的细胞遗传学证据. 本研究对于探索脊椎动物的多倍化和进化具有极其重要的意义.
1 方法
1.1 样品来源
2012~2014年间, 在湖南省洞庭水系统的沅江流域和湘江流域收集了所有的鲫鱼样品, 然后湖南师范大学的教育部工程研究中心进行饲养和繁殖. 实验是按照农业研究中农业动物的护理和使用规范及其教学指导方针进行处理. 在本文进行的实验不需要野生动物行政主管部门批准. 实验用鱼在使用前用100 mg/L MS-222(Sigma-Aldrich公司, 美国)对其深度麻醉.
1.2 染色体的制备
为了确定实验鱼的倍性水平, 从15月龄的实验鱼上抽取外周血进行培养后制备染色体. 用吸入有0.1%肝素钠的注射器从每条实验鱼收集0.2 mL的血液样本. 将外周血细胞在25.5℃, 5%CO2环境下的培养基中培养68~72 h, 然后在收集培养产物前3.5 h加入秋水仙碱. 通过离心收集细胞, 然后加入0.075 mol/L氯化钾溶液, 在26℃下进行低渗处理25~30 min, 最后在甲醇:冰醋酸 (3:1, 体积比)混合溶液中固定. 将细胞滴到冷冻玻片, 自然风干, 并用4%吉姆萨溶液染色30 min. 将制备的染色体玻片在放大倍率为3330×的油镜检查下, 对清晰的染色体分裂相拍照. 每种实验样品中, 共200个染色体中期分裂相被检测(每条实验鱼检测20个).
1.3 荧光原位杂交技术
利用引物5′-GCTATGCCCGATCTCGTCTGA-3′和5′-CAGGTTGGTATGGCCGTAAGC-3′,5′-AAG-CTTTTCTCTCTAGTAGAGAAAGC-3′和5′-TTGAG- CAGATTTGGGCTTGATTTC-3′在二倍体鲫鱼基因组中分别扩增出5S rDNA序列和物种特异性的着丝粒序列, 并以这些序列为模板, 采用PCR法以Dig-11-dUTP间接标记探针(PCR DIG Probe Synthesis Kit, Roche, Germany), 纯化探针后在各种实验鱼有丝分裂中期染色体标本上进行荧光原位杂交(FISH). 具体的FISH实验步骤参考He等人研究[20]. 每种实验样品种, 共200个染色体中期分裂相被检测(每条实验鱼检测20个).
2 结果
2.1 检查染色体数目
表1列出了2nCC和3nCC染色体数目的分布. 2nCC有92%的染色体中期分裂相拥有100条染色体(图1A), 这表明它们是具有100条染色体的二倍体鲫鱼. 3nCC有83.5%的染色体中期分裂相拥有150条染色体(图1B), 表明它们是具有150条染色体的三倍体鲫鱼. 在3年时间内(2012~2014年), 陆续从洞庭湖水系中采集了300条鲫鱼样本, 其中2nCC和3nCC个体比例各占22%和78%, 但是一直没能检测到四倍体鲫鱼(4n=200)样本.
2.2 荧光原位杂交技术
利用5S rDNA(340 bp)探针对2nCC、3nCC、鲤鱼(Cyprinus carpio)和团头鲂的中期染色体分裂相进行FISH实验, 相关结果见表2. 在2nCC中, 有86%的染色体中期分裂相(图2B)拥有2强和2弱的5SrDNA位点. 通过染色体位点图谱分析, 发现这2个强位点定位于1对同源的亚中部着丝粒染色体上, 2个弱位点定位于1对同源的亚端部着丝粒染色体上(图2A). 这说明2nCC每套染色体中拥有1个强的和1个弱的5S rDNA位点. 在3nCC中, 有79%染色体中期分裂相(图2C)拥有3强和3弱的5S rDNA位点,这表明3nCC个体拥有3套染色体. 然而, 在鲤鱼和团头鲂的染色体分裂相中没有发现相应的5S rDNA位点信号(图2D和E).
利用物种特异性的染色体着丝粒探针进行FISH实验, 2nCC的100条染色体均标记上荧光信号(图3A), 但是在鲤鱼(图3D)、团头鲂(图3E)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformis)(表2)的染色体分裂相中均未发现荧光信号. 这说明该探针能特异标记鲫鱼染色体. 在3nCC中, 有84.5%的染色体中期分裂相其150条染色体均被标记上荧光信号(图3B), 这表明3nCC的150条染色体均来自于鲫鱼. 研究结果为3nCC是同源三倍体起源提供了直接的证据.
3 讨论
广泛认为硬骨鱼类比哺乳动物多经历了一次全基因组复制即3R假说. 第三轮全基因组复制(3R)可能发生在约3.6亿年前并产生了辐鳍鱼进化分支, 早于硬骨鱼[21]. 鲤鱼和鲫鱼(2n=100)的染色体数目是其他鲤科鱼类的两倍. 因此, 推测鲤鱼和鲫鱼经历第四轮全基因组复制(4R)[22,23]. 近些年来, 大量研究结果均表明多倍体鲫鱼在成功经历了几次基因组加倍后又在最近经历了一次额外的全基因组复制事件[7,24,25]. 在洞庭湖水系中, 鲫鱼复合体群体中表现出二倍体形式(2n=100)和多倍体形式(3n=150, 4n=200)共存的特点. 虽然二倍体鲫鱼与多倍体鲫鱼在外形特征上非常相似, 但在他们的繁殖模式却明显不同[10~12]. 相对于二倍体鲫鱼(2n=100)来说, 三倍体鲫鱼(3n=150)虽然不是全基因组复制, 但还是能说明当前自然界中还在自发地进行基因组复制. 在洞庭水系统鲫鱼群体中有四倍体(4n=200)个体有记录[6], 但是本研究收集的鲫鱼样品中未检出这一倍性的个体. 这可能是因为在鲫鱼复合体群体中四倍体鲫鱼个体的比例很小, 所以在有限的样品中未能检测到.
Interest statement 同等贡献
References
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鲫鱼(Carassius auratus)广泛分布于整个欧亚大陆. 虽然在银鲫(Carassius auratus gibelio)群体中早已发现了3种不同倍性个体的存在[1~3], 但是鲫鱼一直被认为是只存在二倍体形式(2n=100)[4,5]. 自20世纪80年代以来, 三倍体鲫鱼(3n=150)和四倍体鲫鱼(4n=200)被相继报道[6]. 因此, 鲫鱼才被发现具有二倍体和多倍体共存的特点. 在鲫鱼复合体群体中[7~9], 二倍体和多倍体鲫鱼的外形特征非常相识, 但是繁殖方式却又明显不同. 二倍体鲫鱼的繁殖方式为两性繁殖, 而多倍体鲫鱼表现出同时具有单性雌核发育和有性繁殖的双重繁殖模式[10~12]. 虽然鲫鱼复合体中的染色体数目与核型多样性说明了多倍体鲫鱼(3n=150和4n=200)是三倍体和四倍体起源[6,13,14], 但是一直缺乏直接的遗传证据. 此外, 多倍体鲫鱼染色体组中的额外组染色体是否来自相同或亲缘关系较近的物种(“同源多倍体”), 或者来自不同物种(“异源多倍体”)并不是很清楚.
5S rDNA和物种特异性着丝粒序列拥有大量拷贝数, 并且表现出明显的物种特异性. 它们在染色体上的位置可以通过相应的分子探针进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)而轻松检测到[15~20]. 在以前的研究中, 通过使用5S rDNA和物种特异性的着丝粒探针进行FISH实验, 证明了通过红鲫(Red crucian carp)(2n=100, AA)(♀)×团头鲂(Megalobrama amblycephala)(2n=48, BB)(♂)杂交获得的异源四倍体鲫鲂(4n=148, AABB)能同时产生具有3套(3n=150, AAA)和2套红鲫染色体的配子(2n=100, AA)[18,19]. 本研究使用这些探针进行FISH实验, 为证明拥有150条染色体的鲫鱼是同源三倍体起源提供了直接的细胞遗传学证据. 本研究对于探索脊椎动物的多倍化和进化具有极其重要的意义.
1 方法
1.1 样品来源
2012~2014年间, 在湖南省洞庭水系统的沅江流域和湘江流域收集了所有的鲫鱼样品, 然后湖南师范大学的教育部工程研究中心进行饲养和繁殖. 实验是按照农业研究中农业动物的护理和使用规范及其教学指导方针进行处理. 在本文进行的实验不需要野生动物行政主管部门批准. 实验用鱼在使用前用100 mg/L MS-222(Sigma-Aldrich公司, 美国)对其深度麻醉.
1.2 染色体的制备
为了确定实验鱼的倍性水平, 从15月龄的实验鱼上抽取外周血进行培养后制备染色体. 用吸入有0.1%肝素钠的注射器从每条实验鱼收集0.2 mL的血液样本. 将外周血细胞在25.5℃, 5%CO2环境下的培养基中培养68~72 h, 然后在收集培养产物前3.5 h加入秋水仙碱. 通过离心收集细胞, 然后加入0.075 mol/L氯化钾溶液, 在26℃下进行低渗处理25~30 min, 最后在甲醇:冰醋酸 (3:1, 体积比)混合溶液中固定. 将细胞滴到冷冻玻片, 自然风干, 并用4%吉姆萨溶液染色30 min. 将制备的染色体玻片在放大倍率为3330×的油镜检查下, 对清晰的染色体分裂相拍照. 每种实验样品中, 共200个染色体中期分裂相被检测(每条实验鱼检测20个).
1.3 荧光原位杂交技术
利用引物5′-GCTATGCCCGATCTCGTCTGA-3′和5′-CAGGTTGGTATGGCCGTAAGC-3′,5′-AAG-CTTTTCTCTCTAGTAGAGAAAGC-3′和5′-TTGAG- CAGATTTGGGCTTGATTTC-3′在二倍体鲫鱼基因组中分别扩增出5S rDNA序列和物种特异性的着丝粒序列, 并以这些序列为模板, 采用PCR法以Dig-11-dUTP间接标记探针(PCR DIG Probe Synthesis Kit, Roche, Germany), 纯化探针后在各种实验鱼有丝分裂中期染色体标本上进行荧光原位杂交(FISH). 具体的FISH实验步骤参考He等人研究[20]. 每种实验样品种, 共200个染色体中期分裂相被检测(每条实验鱼检测20个).
2 结果
2.1 检查染色体数目
表1列出了2nCC和3nCC染色体数目的分布. 2nCC有92%的染色体中期分裂相拥有100条染色体(图1A), 这表明它们是具有100条染色体的二倍体鲫鱼. 3nCC有83.5%的染色体中期分裂相拥有150条染色体(图1B), 表明它们是具有150条染色体的三倍体鲫鱼. 在3年时间内(2012~2014年), 陆续从洞庭湖水系中采集了300条鲫鱼样本, 其中2nCC和3nCC个体比例各占22%和78%, 但是一直没能检测到四倍体鲫鱼(4n=200)样本.
2.2 荧光原位杂交技术
利用5S rDNA(340 bp)探针对2nCC、3nCC、鲤鱼(Cyprinus carpio)和团头鲂的中期染色体分裂相进行FISH实验, 相关结果见表2. 在2nCC中, 有86%的染色体中期分裂相(图2B)拥有2强和2弱的5SrDNA位点. 通过染色体位点图谱分析, 发现这2个强位点定位于1对同源的亚中部着丝粒染色体上, 2个弱位点定位于1对同源的亚端部着丝粒染色体上(图2A). 这说明2nCC每套染色体中拥有1个强的和1个弱的5S rDNA位点. 在3nCC中, 有79%染色体中期分裂相(图2C)拥有3强和3弱的5S rDNA位点,这表明3nCC个体拥有3套染色体. 然而, 在鲤鱼和团头鲂的染色体分裂相中没有发现相应的5S rDNA位点信号(图2D和E).
利用物种特异性的染色体着丝粒探针进行FISH实验, 2nCC的100条染色体均标记上荧光信号(图3A), 但是在鲤鱼(图3D)、团头鲂(图3E)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformis)(表2)的染色体分裂相中均未发现荧光信号. 这说明该探针能特异标记鲫鱼染色体. 在3nCC中, 有84.5%的染色体中期分裂相其150条染色体均被标记上荧光信号(图3B), 这表明3nCC的150条染色体均来自于鲫鱼. 研究结果为3nCC是同源三倍体起源提供了直接的证据.
3 讨论
广泛认为硬骨鱼类比哺乳动物多经历了一次全基因组复制即3R假说. 第三轮全基因组复制(3R)可能发生在约3.6亿年前并产生了辐鳍鱼进化分支, 早于硬骨鱼[21]. 鲤鱼和鲫鱼(2n=100)的染色体数目是其他鲤科鱼类的两倍. 因此, 推测鲤鱼和鲫鱼经历第四轮全基因组复制(4R)[22,23]. 近些年来, 大量研究结果均表明多倍体鲫鱼在成功经历了几次基因组加倍后又在最近经历了一次额外的全基因组复制事件[7,24,25]. 在洞庭湖水系中, 鲫鱼复合体群体中表现出二倍体形式(2n=100)和多倍体形式(3n=150, 4n=200)共存的特点. 虽然二倍体鲫鱼与多倍体鲫鱼在外形特征上非常相似, 但在他们的繁殖模式却明显不同[10~12]. 相对于二倍体鲫鱼(2n=100)来说, 三倍体鲫鱼(3n=150)虽然不是全基因组复制, 但还是能说明当前自然界中还在自发地进行基因组复制. 在洞庭水系统鲫鱼群体中有四倍体(4n=200)个体有记录[6], 但是本研究收集的鲫鱼样品中未检出这一倍性的个体. 这可能是因为在鲫鱼复合体群体中四倍体鲫鱼个体的比例很小, 所以在有限的样品中未能检测到.
鲫鱼复合体群体中的染色体与核型的多样性 说明了多倍体鲫鱼(3n=150和4n=200)是三倍体和 四倍体的起源[13,14]. 然而直到现在, 也没有直接的 遗传学证据. 虽然已有研究揭示了多次同源多倍化发生在鲫鱼复合体群体中[7], 但是本研究最重要的发现是为证明150条染色体的鲫鱼是同源三倍体的起源提供了直接的细胞遗传学证据. 那么鲫鱼复合体中同源三倍体鲫鱼可能的起源是什么? 一些研究推测是杂交导致了自然界中的多倍体鱼形成. 例如, 异育银鲫就被认为是起源于远古时期雌性二倍体鲫鱼与雄性鲤鱼的杂交[26]. 通常来说, 由于染色体来源于两个不同的物种, 远缘杂交是形成异源多倍体, 而不形成同源多倍体[27]. 事实上, 远缘杂交是可以通过特殊的减数分裂方式诱导同源多倍体形成[19]. 以前的研究中, 在红鲫(2n=100, AA)(♀)×团头鲂(2n=48, BB)(♂)的远缘杂交后代中获得了两性可育的异源四倍体鲫鲂群体(4n=148, AABB)[28,29]. 有趣的是, 异源四倍体鲫鲂在减数分裂过程中发生了亲本染色体完全分离, 导致产生了同源三倍体的配子(AAA), 同源二倍体配子(AA)和单倍体配子(A)[18]. 因此, 当异源四倍体鲫鲂的同源二倍体精子和同源二倍体卵子受精后获得了两性可育同源四倍体鱼(4n=200, AAAA), 并形成了遗传稳定的同源四倍体鱼品系(F2~F8)[19]. 因此推测, 洞庭湖水系中的同源三倍体鲫鱼来源于雌性的二倍体鲫鱼和不同物种的雄性鱼类杂交.
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图 1：2nCC和3nCC的中期染色体分裂相
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图 2：5S rDNA探针杂交信号
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图 3：物种特异性的染色体着丝粒探针杂交信号
表 1 2CC和3CC染色体数目的分布|
鱼类 |
中期染色体数目 |
染色体数目分布 |
|
|
|
|
|
|
<100 |
100 |
<150 |
150 |
|
2nCC |
200 | 16 | 184 | - | - |
|
3nCC |
200 | - | - | 33 | 167 |
表2：2CC、3CC、鲤鱼、团头鲂、草鱼和翘嘴红鲌探针杂交信号
|
鱼类 |
染色体数目 |
着丝粒探针 |
5S rDNA探针 |
|
|
|
|
位点数目 |
强信号数 |
弱信号数目 |
|
2nCC |
100 | 100 | 2 | 2 |
|
3nCC |
150 | 150 | 3 | 3 |
|
鲤鱼 |
100 | 0 | 0 | 0 |
|
团头鲂 |
48 | 0 | 0 | 0 |
|
草鱼 |
48 | 0 |
未检测 |
|
| 翘嘴红鲌 | 48 | 0 | 未检测 |
Interest statement 同等贡献
References
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