渔用抗菌药物代谢动力学和残留的研究现状
发表时间:2017/11/26 00:00:00 浏览次数:2724
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渔用抗菌药物代谢动力学和残留的研究现状
唐雪莲 王群 李健
(中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛266071)
关键词：药物，代谢动力学，水产养殖
中签分类号：S96；S859.84 R969.1 文献标识码：A
随着生活水平的不断提高，人们对水生动物食品的需求量亦不断增加。我国有水产养殖的天然优势，海岸线长、江河湖泊资源丰富，适合水产养殖业的发展。八十年代以来，我国水产养殖规模飞速扩大，集约化程度不断提高，到1999年养殖产量已占渔业总产量的58%多年居世界首位。但是在养殖产量提高的同时，由于养殖规模扩大、自身有机污染积累、养殖生态环境恶化及区域间苗种的频繁交流等因素影响，致使各种疾病的发生率越来越高，给养殖业造成严重损失[1]。据初步统计：1999年全国水产养殖生产中因病害给渔业造成的损失超过170亿元，其中海水养殖较严重，经济损失约110亿元[2]。水生动物疫病的发生不但降低了养殖产量，而且导致水产品质量下降，对食用者的健康安全也有潜在威胁，已严重影响了渔业的可持续发展。
水产养殖中细菌性疾病是常见的多发病，目前药物防治是重要的措施之一。据报道我国渔用抗菌药物的研究多偏重于药效和毒理方面，药物代谢动力学及药物残留方面的研究较少；而国外在这些方面的研究非常多，值得我国同行借鉴。本文对各类常用抗菌药物的药物代谢动力学、药物残留及检测方法等研究状况进行综述，期望能对我国渔用药物相关研究起到促进作用。
1渔用抗菌药物应用中存在的主要问题
目前我国水产养殖常用的抗菌药物有抗生素类、磺胺类、喹诺酮类及硝基呋喃类等。由于我国渔用药物的开发研究较晚，专门从事渔药研究的人员不多，大部分渔药是从人药或兽药移植而来，对药物在鱼体内的作用机理、药物代谢动力学、药物残留等基础理论的研究较少，在给药方法、给药剂量、给药间隔时间、休药期上等都没有一个明确的准，致使药物使用效果不明显或不安全，已影响了养殖生产。生产中滥用药物的现象普遍存在，长期的药物使用使细菌发生基因突变或转移，使病原产生耐药性。近年来研究证明，细菌对水产常用药物如氯霉素、土霉素、磺胺类、敌百虫等的耐药性已大大提高。如鳗鲡的赤鳍病病原菌一嗜水气单胞杆菌对药物的平均耐药率为69.4%，人工分离的大西洋鲑疖疮病病原菌—杀鲑气单胞菌有55％的菌株对土霉素有抗性，37％的菌株对口恶喹酸有抗药性。另一方面，由于药物的使用方法不规范，造成药物使用后在动物体内的残留问题越来越严重。如在1999年全国水产品药物残留监控抽查中发现北方某养殖场的牙鲆体内土霉素残留严重超标，养殖中华鳖体内激素残留过量等现象[3]。残留超标不仅影响产品的质量，而且严重威胁人体的健康，对出口贸易也产生了不良影响。美国、欧盟、日本等对养殖水产品中药物的残留危害非常重视，对药物的使用规范和安全性都制定了严格的法规，对于一些致癌类的药物和对人体构成潜在威胁的药物规定不得检出，对允许使用的化学治疗药物规定了允许残留的限量，同时根据药物残留的结果确定相应的停期。我国近年来也加强了渔用药物的管理工作，农业部渔业局于1996年始组织黄海水产研究所、长江水产研究所等单位进行了一系列药物代谢和残留研究等工作，相信经过几年的努力，我国渔用抗菌药物的使用、管理将更加规范。
2渔用抗菌药物药动学及残留研究进展
药物代谢动力学是利用动力学的原理研究药物及其代谢产物在体内的动态变化规律的一门学科，并以数学作为手段分析药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程的量变规律。研究药动学的意义在于通过对药物的吸收、分布、代谢和消除特征的研究，发现药物在体内的转变规律，弄清药物的疗效、毒性与药物浓度的关系，药物在体内的积蓄部位及积蓄程度，从而为临床安全和合理用药提供依据，同时还用于指导剂型的选择和新药的开发[4，5]。药物代谢和残留的研究应首先从检测方法上着手，传统的检测方法有微生物测定法、分光光度法等，随着科学技术的进步，高效液相色谱法(HPLC)及气相色谱法(GC)等先进的检测方法得到发展，尤其是高效液相色谱法已成为国内外研究药物代谢和残留的首选方法。鉴于药物残留工作的重要性，国外的许多学者对药物残留方面的研究从来没有停止过，他们在残留检测方法上做了大量的工作，对禁用药物和非禁用药物的残留标准做了严格规定。
2.1抗生素类药物
水产养殖中常用的抗生素类药物有土霉素、金霉素、氯霉素、链霉素等，其中研究最多的是土霉素(OTC)。日本、美国、加拿大、挪威、意大利及中国等分别对OTC在虹鳟、鳗鱼、香鱼、对虾、鲤鱼、大西洋鲑、黑鲷、鲈鱼体内的药物代谢动力学特征和残留进行了研究，研究的给药方法多为口服、混饲和血管内注射。
2.1.1药动学
许多研究表明OTC通过口服给药后，药物在体内的代谢符合三室动力学模型，混饲给药的生物利用率非常低，E1ema(1996)报道大西洋鲑口服药饵的生物利用度为2%[6]；Craved(1987)报道虹蹲口服给药的生物利用度低于10%[7]：Bjorkllund(1991)报道以悬液给药的生物利用度为5.6%[8]；Nouws(1992)报道丸状饵料在鲤鱼体内的生物利用度为0.38％，虹蹲体内为1.25%[9]。
OTC在各种鱼的体内吸收和分布较慢，Elema(1996)报道大西洋鲑口服药饵后40-50h内，药物浓度仍保持恒定：Rogstad(1991)报道淡水虹蹲口服给药，血浆和肝脏在给药后72h有相同的浓度值，肌肉中的达峰时间为96h[10]；王群等报道土霉素在黑鲷体内一级吸收速率常数Ka为0.296h-1，最高血药浓度Cmax为1.398μg/ml[11]。低的吸收会导致大量药物通过胃肠道排出体外，影响治疗效果。
OTC的消除速度很慢，Rogstad(1991)报道OTC给药2周后，虹蹲血浆中药物浓度仍为0.64μg/ml，而肌肉和肝脏中浓度分别为1.94和12.0μg/ml，血浆中OTC的消除半衰期为11.6d。Elema报道大西洋鲑在给药后100-150h内血浆浓度仍持续在1-2μg/ml，消除半衰期为50.7h。OTC属于四环素类药物，四环素类药物易与二价或三价阳离子结合，当给鱼口服喂药，OTC不可避免地与海水中或鱼体内的Ca2+、Mg2+结合，结合后的药物不易穿过细胞脂膜，吸收结合的OTC是不可能的，因此导致药物吸收的缓慢和不完全。消除速度很慢，虽然有利于维持一定的血药浓度，但就安全消费而言，需要较长的休药期。
2.1.2残留
抗生素残留检测研究较多的是OTC，许多国家对进出口商品中OTC的残留限做了规定。美国规定鲑鱼等可食性组织中OTC的残留限为0.1μg/g：加拿大规定鲑鱼在10℃以上时，OTC的休药期应为40天，10℃以下应为80天。目前OTC残留检测主要采用液相色谱法，Carignan(1993)报道了采用液相色谱测定0TC在鲑鱼肌肉中的残留，用含1/10体积的二氯甲烷的1％的偏磷酸提取，流动相为乙腈（四氢呋喃）0.025M的草酸水溶液(体积比为9:1:30)，355nm紫外检测，检测限为0.05μg/g，该方法的回收率为85.8％—90.3%[12]。Meinektz(1998)研究了OTC在六种可食性鱼组织中的含量，样品用提取液提取后，又用(固相萃取柱)SPE柱净化，此法在0.1ppm-5ppm之间的回收率为83—90％，说明该方法的准确性和灵敏度都很高[13]。
由于氯霉素能引起人的再生障碍性贫血，在许多国家已禁用，所以研究主要集中于残留检测方法的探索。畜禽组织、乳品和鸡蛋中研究较多，水产品中研究还较少。李爱华(1996)报道氯霉素在草鱼和复合四倍体异育银鲫的药物代谢动力学[14]，李兰生(1995)对对虾体内氯霉素的含量进行了测定[15]。
2.2磺胺类药物
磺胺类药是最早应用于预防和治疗细菌感染的化学合成药，磺胺-6-甲氧嘧啶(SMM)、磺胺-2.6-二甲氧嘧啶(SDM)均属长效磺胺类药，抗菌力强，口服后吸收良好，副作用小：磺胺甲口恶唑(SMZ)属中效磺胺类药，抗菌谱广，乙酰化率高：磺胺嘧啶(SD)属中效磺胺类药，抗菌力强。由于磺胺增效剂(三甲氧苄氨嘧啶TMP)的出现，它与磺胺类药物联合应用，使磺胺药的抗菌作用增加十倍甚至数十倍，并出现强大的杀菌作用。磺胺类药物进入组织中最易发生的作用是乙酰化，乙酰化后的药物失去杀菌作用，不同的磺胺类药物乙酰化的程度是不同的，在不同的组织乙酰化率也不一样。
2.2.1药动学
早在1951年就有磺胺类药在鱼体内的浓度变化的报道，随着磺胺类药在水产中的广泛应用，国内外对该类药物在鱼体内的药物代谢动力学研究进展很快。日本、美国、加拿大和挪威等国家分别研究了磺胺类药物在虹鳟、大西洋鲑、蟹鲡、大鳞大麻哈鱼、黄尾鲴、鲈鱼和对虾等体内的药动学，研究的最多的药物为SMM和SDM，给药方式多为口服、混饲和血管内注射等。
不同的磺胺类药物药动学规律不同，SMM和SDM在不同动物中血管内给药都适合，口服及混饲给药适合一室模型。SMM在不同动物中的吸收和消除半衰期都比SDM长，Uno(1993)报道SMM的吸收和消除半衰期Tα1/2、Tβ1/2分别为6.9h、32.6h，而SDM2、Tβ1/2分别为5.0h、24.5h；在峰浓度时组织中的药物浓度不同，SMM在组织中浓顺序为胆汁(85.8μg/ml)、血浆(39.6μg/ml)、肝脏(22.6μg/g)、肾脏(21.7μg/g)、肌肉/g)，SDM的高低顺序为胆汁(352μg/ml)、肝脏(38.6μg/g)、血浆(36.1μg/ml)、肾脏/g)、肌肉(17.3μg/g)[16]。王群(2001)报道了复方新诺明(SMZ+TMP)在鲈鱼体内的药物学，其中主要成分磺胺甲基异口恶唑SMZ的Tα1/2、Tβ1/2分别为7.25h和38.30浓度的高低顺序为血液(60.83μg/ml)、肌肉(59.09μg/ml)、肾脏(29.75μg/ml)、肝脏(/ml)[17]。主要原因：SMZ是乙酰化较重的药物，且肝脏和肾脏的乙酰化程度较其他所以原药的含量低。另外同种药物在不同动物中代谢规律不同，Ueno(1998)报道鲡中的消除时间比在虹蹲和黄尾鲴中长，分布半衰期为虹蹲和黄尾鲴的1/2,口服的除均比二者慢。SMM在黄尾鲴中的消除半衰期是虹蹲的3.6倍，表明黄尾鲴的消除[18]。
磺胺类药在哺乳动物体内的代谢主要有乙酰化(Acetylation)、葡萄糖化(G1ucurjugate)过程，近年来研究证明在水产动物中也同时存在这两种过程，以乙酰化为主，为少数，同时还发现这两种代谢过程的混合产物。Uno(1993)报道乙酰化产物Ac后0.5h在肝脏和肾脏中即可检测到，而其他组织在3h可检测到，AcSDM给药后中即可检测到，其他组织在9h可检测到，在32d时，AcSMM在各组织中均可检测cSDM检测不到。研究中还观察到N4-acetyl-代谢物的解乙酰作用(Deacetylation)的存明，N4-acetyl-代谢物可以通过这种作用转化为原药而在动物中造成残留，此过程还一步的研究。
许多研究证明蛋白结合率同样影响药物的浓度与分布，只是结合率低影响较小。Uno (1997)报道在虹鳟和黄尾鲴中，SMM、AcSMM的蛋白结合率都很低[19]。Kleinow(1992)报道SDM的蛋白结合率在体内和体外都很低，在2、6、24、72h，血浆蛋白结合率分别为16.6、16.2、13.5、16.8％[20]。
Uno(1993)报道SMM在体内的变化范围为血浆中的14天至胆汁中的26天，SDM在体内的变化范围为血浆中的11天至胆汁中的27天。日本规定这两种药物用于治疗鱼病时在虹鳟体内的休药期为30天，Uno的实验证明30天的休药期是可行的。然而，由于乙酰化作用和葡萄糖化作用的存在，休药期的确定需要进一步的研究。
2.2.2残留
国外近几年来对磺胺药残留的检测研究较多，反相液相色谱法，荧光检测、紫外检测等各种快速灵敏的方法普遍被采用。Gehring(1995)报道了反相液相色谱法通过柱后衍生化和荧光检测器联用来检测鲑鱼肌肉组织中“ng”级磺胺嘧啶(SDZ)的含量，SDZ用2％醋酸乙腈提取后，加入二氯甲烷分层，用强离子交换剂清洗固相提取柱，SDZ被荧光胺柱后衍生化后，用荧光检测器检测，激发波长：ex＝400nm：发射波长：em＝495nm，最低检测限为0.2ng/g，回收率在银鲑组织中1、5、10、20ng/g的范围内分别为84.5％、85.0％、83.6％、83.9％，在大西洋鲑组织中10ng/g的平均回收率为82.6％[21]。
Walker(1994)报道了一种简单、快速、同时测定SDM及其代谢物N-acety-SDM在斑点叉尾鮰体内的检测方法，SDM在肌肉中的回收率为79％,在血液中的回收率为67％，该方法的检测限对SDM及N4·—acetyl—SDM在肌肉中为26ng/g，SDM在血浆中的检测限为33ng/g，N4-acetyl-SDM在血浆中的检测限为11ng/g[22]。
Gentleman(1993)报道了HPLC法检测大鳞大麻哈鱼肌肉组织中SDZ和甲氧苄啶(TMP)的含量。流动相为甲醇：0.05M磷酸缓冲液(17：83，v／v)，波长280nm，紫外检测条件下检测SDZ；乙腈：0.05M磷酸缓冲液(5：95，v／v)，波长224nm，紫外检测条件下检测TMP。SDZ和TMP分别在0.1—10μg/g、0.1—15μg/g的范围内呈线性，最低检测限为o.1μg/g，两者的回收率分别为63％—42％[23]。以上各方法是检测磺胺类残留的较典型的方法。Walker法同时检测原药和代谢物N4—acetyl。SDM，这对于磺胺药的安全性研究来说很重要。总的来说，国内外对磺胺类药物的研究已比较全面，为此类药的临床应用提供较充分的依据。
2.3喹诺酮类
喹诺酮类药物在医学和兽医学中已有了较详细的研究。水产养殖中鱼虾类疾病防治中经常使用的药物主要有诺氟沙星和恶喹酸等，由于其抗菌谱广，杀菌能力强，在国外水产上是继土霉素之后在水产养殖中应用最多的药物，目前第三代氟哇诺酮类药物出现后，表现出更强的抗菌和杀菌力，成为一种比较有前途的新药。
2.3.1药动学
关于喹诺酮类的药动学主要在鲤鱼、大西洋鲑、中华鳖、鲈鱼等动物体内进行了研究。其中国外研究较多的是氟甲喹和口恶喹酸；国内对诺氟沙星的药动学研究较多，口恶喹酸也有报道。
Odd(1993)报道了用不同的给药方法分析大西洋鲑体内FLU和OA的药物代谢动力学和生物利用度，目的是比较两种药物的不同代谢情况。药物代谢结果分析0A的分布半衰期为0.7h，吸收速度很快，一次性口服25mg/kg后，血浆药物高峰为0.99μg/ml，oA在剂量为50mg/kg时的生物利用度为25％，剂量为25mg/kg时的生物利用度为40％，实验结果表明FLU和0A的药物分布型差别很大[24]。李健(2001)报道了鲈鱼口服口恶哇酸的代谢和残留，药物在体内的代谢符合一室动力学模型，药物在16h达最高血药浓度，在各组织中的浓度分别为肾脏(6.55μg/ml)、肝脏(5.72μg/ml)、肌肉(4.91μg/ml)、血液(2.95μg/ml)，Tα1/2、Tβ1/2分别为6.14h和10.28h(1)。陈文银等研究了诺氟沙星在中华鳖体内的药代动力学，用反相液相色谱法测定中华鳖口服诺氟沙星后体内的血药浓度。结果显示，吸收半衰期为2.30h，达峰时间为4.58h，峰浓度为3.27μg/ml，消除半衰期为4.24h[25]。而张雅斌等研究了不同给药方式下鲤鱼对诺氟沙星的药代动力学，结果肌注和口服的诺氟沙星的药时数据符合开放性二室模型，混饲符合开放性一室模型，肌注给药的主要药动学参数为AUC(24.948ug.h.ml-1)，Cmax(16.8992μg/ml)，T 1/2α(0.1279h)，T 1/2β(3.4032h)：口服给药的主要药动学参数为AUC(150.6029μg.h.ml-1)，Cmax(5.7998μg/ml)，T1/2α(3.4071h)，Tβ1/2(77.1239h)；混饲给药的主要药动学参数为AUC(6.8183μg.h.ml-1)，Cmax(1.7217μg/ml)，T1/2α(0.22643h)，T 1/2β(2.0213h)[26]。以上的结果表明诺氟沙星的吸收速度较快，峰浓度高，消除较慢，不同给药方式的药代动力学参数差异显著，口服给药的血药浓度曲线符合单室模型一级吸收。
2.3.2残留
Plakas(1999)报道了用液相色谱法检测斑点叉尾鮰体内氟甲喹的含量，样品用SPE柱净化，在肌肉中的回收率为87％-94％，血液中的回收率为92％-94％，该方法的检测限可达3-6ppb[27]。Turnipseed(1998)报道液相和质谱连用检测鱼组织中四种氟喹诺酮类药物的含量[28]。Carigan(1991)在实验室中利用液相色谱及荧光检测器测定。恶喹酸在鲑鱼肌肉中的残留，样品采用乙基醋酸盐提取，样品的回收率为77.2％-84.5%[29]。Barker(1994)采用生物学方法检测虹蹲肌肉中口恶喹酸的残留，利用分离的耶尔森菌属的敏感菌，最低检测限为0.02μg/ml[30]。
2.4硝基呋喃类
硝基呋喃类是合成的抗生素药物，它能作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类代谢，因而能有效的抑制养殖动物体上由细菌和真菌引起的疾病，呋喃类首先用于水产上的试验是1946年在虹蹲体内进行的，其毒理研究于1960年开始。呋喃类药物在治疗上非常有效，但由于其具有致癌作用，对人体的健康构成威胁，美国食品和医药管理委员会不允许任何硝基呋喃类物质应用于养殖业上。欧盟于1995年6月26日也把呋喃唑酮列入禁用药物之一，并于1997年1月1日正式实施，目前我国在兽药管理方面还不健全，许多方面与国际还没有接轨，呋喃类药物在我国并没有禁止使用，常用的有呋喃唑酮和呋喃西林等。
2.4.1药动学
本类药物由于在国外禁止使用，所以药动学研究较少见。仅有Heaton(1968)用分光光度法对虹蹲、美洲红点鲑、蹲鱼体内的呋喃类药物进行吸收和排泄的研究[31]，Shimzu和Takase(1967)用生物测定法证明该类药物在鳗鱼体内含量高的部位是皮肤和肾脏。
2.4.2残留
国外主要是英美等国家研究了虹蹲、对虾等动物中的残留。Rupp(1993)采用液相色谱和紫外检测器同时测定对虾肌肉内呋喃西林和呋喃唑酮的含量，样品用乙腈提取，采用反相C18柱，乙腈+1％醋酸溶液(25:75)作流动相，在375nm下检测，绝对回收率为70.6~78.4%标准差为4.0~13.6％。样品中两种药物的最低检测限为4ng/g[32]。Stehly(1994)研究了液相色谱检测对虾中呋喃唑酮的残留，用乙腈提取，回收率为74.3~79.7％，标准差为5.0~8.9%[33]。二者相比Rupp的方法比较完善，检测限也很低。
3渔用抗菌药研究中应注意的几个问题
3.1给药方法
研究药物代谢动力学和残留主要有混饲或单纯口服、注射(血管内、肌肉、腹腔)几种，不同的给药方法往往会产生不同的结果，混饲的方法比较简单，与实际养殖的情况比较接近，但投饵的时候不可避免会在水中溶失一部分：同时由于鱼的个体差异，摄食量不同，因此摄入的药量也不同，不能严格地控制给药量，只能通过大量采样来减少差异的产生。单纯口服和注射的给药方法较容易而且精确，但是与实际使用情况有一定的差距，不利于指导实践。
3.2样品处理和检测方法
同一种药物的检测和提取方法有许多种，方法不同，药物的提取回收率、重复性、检测限和灵敏度也不同，同种样品采用不同的提取和检测方法会产生不同的结果，所以标准方法的确立至关重要。
3.3样品采集
采集样品有许多不同的方法，如血样的采集有围心腔采血、尾动脉采血、断尾法采血等几种方法，张雅斌等研究诺氟沙星在鱼体内的药物代谢动力学中得出，围心腔采血测定的血药浓度比尾动脉采血的试验数据重复性好。艾晓辉等报道了断尾法采血与抽血的药物浓度存在较大差异，灌药后4小时血药浓度达到高峰，高峰浓度断尾法采血组达到54.75μg／m1，抽血组达88.54μg／m1(2)。可见，抽血组血药浓度明显高出断尾采样组，原因还需从多方面分析。不同的采血方法对结果有一定的影响，试验中应适当的选择。
3.4实验动物的规格
有试验表明鱼的大小不同，药物在体内代谢的差别非常大，所以研究药物在鱼体内的代谢来确定给药的方法和剂量一定要考虑到鱼的规格，即使同一种规格的鱼也要增加平行来克服个体代谢的差异。
3.5环境条件的影响
试验环境条件如温度的不同对于药物代谢和残留的影响非常大，有研究表明水温每增加l℃会导致代谢幅度增加10％的量，同样盐度等的不同也会影响到药物的吸收。
4展望
虽然人们已经发现使用药物存在许多弊病，但药物在控制水生动物的疾病上仍有不可替代的作用，怎样才能更好地使用药物和加强药物的管理是非常重要的。今后我国渔药研究应加强基础研究，对于不同的药物根据其自身的安全性和代谢的特点而有针对性地控制和使用，如氯霉素和呋喃唑酮是具有潜在威胁的药物，但这两种药物代谢比较快，可以在养殖前期使用；土霉素和磺胺类药物是比较安全的，但残留比较严重，使用后应适当延长用药后水产动物上市的时间。今后应针对水生生物特点，研究药物的离子通道、作用机制、运转规律、转换过程及构效关系等，尽快搞清楚常用抗菌药在水生动物体内的吸收、分布、转化和排泄规律及药物对养殖生态环境的影响。提出在主要养殖水产动物体内的残留期及残留量，制定产品上市前的休药期，研究制定渔药的合理使用方法，以更好的指导水产养殖和渔药生产，为市场提供更多绿色环保水产品。
参考文献（略）。
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