鱼类精液保存技术研究进展与前景展望

陈 健 杨壮志 李良玉 杨 马 唐 洪

鱼类精液保存技术在鱼类繁殖和遗传育种工作中起着至关重要的作用，它能够最长限度地保存雄性亲鱼的种质资源，解决雌雄亲鱼性成熟不同步的问题，提高鱼类精液利用率和配种效率。鱼类精液保存技术广泛应用鱼类育种中，特别是在杂交育种中，它能充分利用杂种优势，改善种质资源退化，进一步优化鱼类的优良性状。

鱼类精液保存技术其实质是降低精子代谢率，减少能量消耗，从而延长精子寿命。精子具有运动能力，所需能量来自于原生质的营养物质，但精子处在稠密环境的精巢内是不活动的，对于体外受精的鱼类，精子遇水后被氧气激活，开始活泼运动，而体内受精的动物则不同，精子液化后即开始活泼运动。

由于精子的原生质极少，能量有限，故精子排入水中被激活后的寿命很短。对于体外受精的鱼类，其精子的寿命较短；体内受精的动物，其精子寿命通常较长，时长达数小时至数日，甚至达到数十日。淡水硬骨鱼的精子寿命为45s～5min左右，这与精子处于低渗环境有关，精子产生的能量既要用于运动又要用于渗透压的调节，会造成能量迅速耗尽。精子的能量还用于调节细胞内外渗透压平衡。鱼类精液的保存就是利用降低精子代谢率的方法减少能量的消耗，从而达到延长精子寿命的目的。随着鱼类养殖业的迅速发展以及杂交育种和优良品种的选育等工作的开展，鱼类精液保存技术的应用越来越 广泛。鱼类精液的保存方法有常温保存、低温冷藏保存和超低温冷冻保存。常温保存和冷藏保存用于短期保存精液，而冷冻或超低温冷冻则用于长期保存精液。本文就鱼类精液保存技术做一简单阐述。

一、常温保存

在常温条件下，即没有冷藏和冷冻等设备，将鱼类精子处于等渗环境中，如利用同种鱼的卵巢提取液或体腔液，减少精子用来调节渗透压平衡的能量消耗，从而延长精子的寿命。

在实践中利用卵巢提取液和体腔液的方法较少，许星鸿研究发现，用0.65%生理盐水代替淡水，鱼类精子受精能力的时间可延长半分钟以上；张崇英等也报道称利用生理盐水代替盐水可提高鱼类受精率。

二、低温冷藏保存

冷藏保存主要是利用低温降低精子的代谢率，通常是在普通冰箱的冷藏室（0～4℃条件下）保存鱼类精液，这种方法操作简便，成本低廉，保存时间较长，可保存精液达几天至数十天，此法可在生产实践中广泛推广使用。龚丽等研究发现，低温冷藏条件下精子寿命可持续到15天左右，精子的密度对于虹鳟精液保存的活力和寿命都有一定影响，高密度的精液会导致精子活力消退和寿命缩短。Stoss J等研究在精原液中加入抗生素和氧气，连晋等研究用人工精浆稀释可有效地保存虹鳟精子达34天和60天。

低温冷藏保存具体做法如下：采集到的鱼类精液放入洁净的器皿中，加入抗生素以抑制微生物的生长繁殖，若在精液中加入合适的稀释液，保存时间将更持久。常用的抗生素有：青霉素，5000IU/mL精液；硫酸新霉素，1mg/mL精液；青霉素1000IU+链霉素5000IU/mL精液；金霉素0.6mg/mL精液等。实践中硫酸新霉素及青霉素+链霉素混合使用其效果更佳。常用的稀释剂：葡萄糖0.3g+柠檬酸钠0.14g+卵黄2mL+蒸馏水10mL；柠檬酸钠0.3g+磺胺粉0.03g+卵黄0.5mL+蒸馏水10mL；氯化钠（7.5mol/L）100份+氯化钾（7.5mol/L）2份+氯化钙（11mol/L）2.1份+碳酸氢钠（10mol/L）2.4份。稀释剂现配现用或配好后放入冰箱冷藏备用（冷藏时间不可超过1周），稀释倍数为6～10倍。

低温保存时精子仍有微弱的代谢，需要消耗氧气，因而盛放精液容器中所装入的精液量只占容器体积的1/10～1/8，使容器存有一定体积空气，为精子的代谢提供氧气，条件允许情况下，可向容器内充入氧气代替空气，精液保存效果更好。低温保存要点：做好密封、防治污染、低温稳定，因此装有精液的容器要用软木塞和石蜡密封好，防治精液蒸发和被污染；在保持冷藏室低温温度稳定前提下，尽可能调低冷藏室的温度，减缓精子代谢，延长精子寿命。

三、超低温冷冻保存

常温保存和低温冷藏保存仅用于短期保存精液，在实践生产和推广应用上有一定的局限性。在鱼类繁殖和育种中，往往出现雌雄亲本性腺发育不同步，雌雄亲鱼性成熟时间跨度大，需要更长时间保存精液，而冷冻或超低温冷冻可以保存精液时间更长，保存时间甚至长达数年之久。超低温条件下，精子的代谢停滞，处于假死状态，代谢和运动完全停止，生命处于静止状态，但细胞结构没有受到损害，解冻后即会复苏。

精子超低温冷冻保存的具体做法如下：采集鱼类精液，加入稀释液和抗冻剂后等温稀释（精液和稀释液稀释比例为1∶3），降温平衡，放入液氮中长期保存，需要时解冻复苏，活力检测。

1.稀释液的添加

稀释液的配制是鱼类精液冷冻保存中至关重要的一步，苟兴能报道称不同的保存液对同一种鱼精子的保存作用是不同的，而同一保存液对不同种鱼的精子保存效果也是不同的。由于鱼种的特异性，不同鱼类精液冷冻保存对稀释液的要求也略微存在差异，但大体类似。稀释液的成分在合适的范围内越简单越好，鱼类精液保存稀释液成分主要包括：盐类（如碳酸氢钠、氯化钠、碳酸氢钾、柠檬酸钠等）、糖类（如葡萄糖、果糖、蔗糖等）、脂类（主要是磷脂）和蛋白质（如卵黄、牛奶、小牛血清等）以及其他添加剂（如维生素、抗生素等）。李常健研究发现，K+能提高精子运动速度，延长精子运动时间；同时Ca2+、Mg2+也是部分鱼类精子活力的重要调节因子，它们浓度的增加可增强其精子活力，延长精子寿命。因此，大多数鱼类的保存液中，应具有一定浓度的 K+、Ca2+、Mg2+等离子。海水鱼类用由葡萄糖和柠檬酸钠组成的稀释液和甘油作为抗冻剂能获得良好的冷冻效果；淡水鱼类稀释液则以氯化钠和氯化钾为主，加入少量氯化钙、氯化镁、碳酸氢钠和葡萄糖，以二甲基亚砜（DMSO）作为抗冻剂，于海涛等报道称10%的DMSO浓度是一个高度有效的浓度，能起到良好的抗冻作用，在实践中已广泛使用。

2.冷冻方法

冷冻方法目前主要使用4种方法：小丸颗粒冷冻法，麦管冷冻法，安瓿瓶冷冻法和塑料离心管冷冻法。（1）小丸颗粒冷冻法：将精液直接滴入干冰孔内，精液冷冻成小颗粒，再转移到液氮中长期保存，此方法冷冻量小，操作较繁琐。（2）麦管冷冻法：冷冻体积较大，操作较简便。（3）安瓿瓶冷冻法：体积较大，冷冻效果也较好，但降温不均匀，瓶口需密封，操作复杂，且在解冻时，安瓿瓶易爆裂，在实践中较少应用。（4）塑料离心管冷冻法：具有冷冻量大、操作简单、应用安全等特点，在鱼类精液保存中已广泛应用。

3.降温平衡

降温平衡步骤是否需要进行因鱼类的种类而异，每种鱼类精液都存在着最佳的冷却速率，在最佳冷却速率条件下会减少细胞损伤，提高精子的存活率。大体而言，目前常采用的下降速率为-10℃/min，到达低温后（-76℃）可直接放入液氮中保存。

4.解冻复苏

在需要使用鱼类精液时，须将精液解冻复苏，该步骤是精子升温溶解复苏的过程。决定解冻复苏效果的关键因素是解冻液和解冻速度。淡水鱼类精液解冻液常用0.65%氯化钠溶液，海水鱼类冻精则可直接利用海水解冻复苏。解冻速度与解冻液的初始温度、解冻液在精液中所占比例、冻精的体积和水浴的温度等有关系，所以解冻速度不能准确测定和控制。一般情况下，若精液冷却过程的速率较快，那么其复温速率也相对较快。

5.活力检测

精液解冻复苏后应立即对精子活力进行检测。在原地摆动或做微弱曲线运动的精子无受精能力，显微镜视野下做直线前进运动的精子所占的比例即为精子活力百分比。

四、小结与展望

随着水产养殖业的迅猛发展、鱼类人工育苗和遗传育种技术工作的不断改善，鱼类精液保存技术受到极大关注，精液保存技术的应用也越来越广泛，特别是在杂交育种、优良品种的选育与种质资源的保护等工作中，精液保存的鱼类种类也越来越多。常见的淡水鱼类、海水鱼类精液保存技术已较为成熟，对于一些濒危和保护水生生物而言，精液保存技术的应用具有十分重要的意义。鱼类精液保存方法由较简便的常温保存、低温冷藏保存向超低温冷冻保存逐步深入，目前，鱼类精液保存技术已日趋完善，但仍存在亟待解决的问题，如冷藏保存和冷冻保存的优化，精液保存后活率低、寿命短等问题有待深入研究解决；针对不同鱼种其特异性的稀释液配方、抗冻剂选择、降温速率、保存方法和解冻条件摸索等问题还需进一步探究。

（通联：611130，四川省成都市农林科学院 成都市温江区）