动物标本的制作方法有很多种，如骨骼标本、风干标本、剥制标本、浸制标本和透明标本等[1]。随着医学影像技术的发展，对骨学及骨发育的形态学提出了越来越高的要求，以往的解剖学或胚胎学骨发育的教学，只限于理论上的讲解及线条观察，缺乏实际的骨标本直观素材，而且风干标本及浸制标本在制作过程中由于实验者直接或间接接触福尔马林溶液危害身体健康。透明标本技术不同于其他标本制作技术，它是一种将动物体肌肉透视化的骨骼展示，呈现出一具骨骼结构清晰、直观的形态学素材，避免了传统标本只可以看到外部形态的束缚，它的创新点在于保持动物基本形态及肌肉不破坏的情况下进行深层次的显露骨骼系统，特别是能体现骨骼结构和位置，真正意义上脱离了传统外观单一的保存方式，无毒无刺激性气味儿，可以近距离观察，是标本保存与展示上的一种革新，为骨骼发育的教学和科研提供了有效的形态学观察方法[2]。1897年Schulze用2%～3%的氢氧化钾茜素红及甘油成功制作了胚胎骨骼的染色标本得到了广泛的推广与应用[3]。透明标本在动物教学范畴中，由于其具有骨骼直观性的特点，通过标本直接观察就可以较易理解它们的骨骼在演化过程中发生的变化，可以直观地感受到骨骼的大小及位置，所以它的出现也成为了解剖学研究中的重要组成部分，对于物种演变及生物遗传多样性的研究、动物资源科学开展的研究、以及研究动物与人之间的关系的重要途径，它清晰地反应了动物不同年龄的骨化点，为当前临床胚胎骨骼发育畸形病理研究提供依据[4]。目前常用的染色方法有硫酸铜浸透法、茜素红染色法、墨汁染色法、双重染色法有茜素红、甲基绿双重染色，甲苯胺蓝—茜素红双色染色法。本实验所采用的透明标本的制作技术相对成熟，阿利新蓝、茜素红单染色及双重染色。

1 材料与试剂

1.1 样品选取

选取鲜活、外表无破损的老板鱼和锦鲤进行制作。样品采购于海鲜市场和水族馆，老板鱼重量在150g左右3条，锦鲤体长20cm左右3条。

1.2 样品预处理

将购买的老板鱼和锦鲤进行流水清洗，首先去除皮肤上的黏液，然后去鳞、鳃及眼睛，其次除去锦鲤外表皮肤，及内脏部分，锦鲤背鳍肌肉组织不宜过厚保留，注意不能破坏骨骼结构及鳍条，取出内脏时尽可能切口小些，不要伤及肋骨，保持鱼体表完整，处理后将标本用透明细鱼线小心捆绑固定在干净的长条玻璃（或高透亚克力板）上，此步骤很重要，方便后续标本转移，将其置于95%酒精中固定。

1.3 主要器皿、药品试剂和溶液配制

1.3.1 实验主要器皿

染色及透明用大号无色透明保鲜盒、容量瓶、滴管、电子天平、烧杯、玻璃棒、烧杯、洗瓶、手术刀、镊子、吸水纸等。

1.3.2 药品及试剂

无水乙醇、氨水、氢氧化钾、茜素红、阿利新蓝、冰乙酸、丙三醇、苯甲酸钠、蒸馏水等。

1.3.3 溶液浓度及配制方法

固定液：将无水乙醇视盛放标本瓶大小配制成为95%浓度的固定液;漂白液：按照氨水∶甘油∶水=1∶5∶15的比例配制漂白剂并混匀;预透明液：配置成5%氢氧化钾溶液;软骨染色液：按照染色液每1L体积，将无水乙醇与冰乙酸进行1∶1混合，并加入200mg阿利新蓝混匀;硬骨染色液：1g茜素红和100 mL95%乙醇混匀， 再与1%氢氧化钾900mL溶液混合;梯度脱色液：分别配置成25%（添加0.5%KOH溶液）、50%（添加0.5%KOH溶液）、75%（添加0.5%KOH溶液）浓度的丙三醇溶液;保存液：100%丙三醇。

2 制作方法及染色步骤

2.1 染色前预处理

将已固定半个月左右的鱼标本取出，用吸水纸吸干，将其放于预透明液中进行腐蚀透明，此环节至关重要，时间不宜腐蚀过长，浓度过低会延长腐蚀时间，浓度过高将导致肌肉松散脱落，影响透明效果，尤为鱼背鳍条部分很容易脱落解体。一般视鱼体厚度及大小，腐蚀透明控制在2d左右，若固定的鱼类标本肌肉不泛白颜色较重，则还需进行一次漂白，以达到最佳透明效果。经腐蚀透明后的肌肉呈半透明状，可以很明显观察到鱼体内骨骼形态。

2.2 骨骼染色

将腐蚀透明后的标本小心拖起，根据软骨及硬骨不同分别置于染色液中，先进行单染，染色时间要根据标本实际状态，要及时观察，避免染色过重过深，特别是肌肉被染料沾染过重时会导致后期脱色难，整体标本透明效果发暗，一般视肌肉厚度和骨骼着色程度，染色时间控制在1d～2d。另外，还可按照研究需求进行双重染色，在硬骨或软骨染色后，进行交换染料双重染色，此时需要随时观察，当出现软骨变蓝、硬骨变红时及时停止染色，用蒸馏水小心冲洗标本表面，洗去标本体表和腹腔内多余染料，直到无浮色溶出即可。

2.3 肌肉脱色

将染色后的鱼标本置于梯度脱色液中，顺序按照浓度低转移至高浓度，每个浓度脱色停留时间为2d～3d，当观察标本肌肉已接近透明状态，软硬骨骼及关节部位色系清晰时表明脱色完成，进入保存环节。

2.4 标本保存

将脱色后的标本转移到100%丙三醇中支撑固定，加入0.6%的苯甲酸钠可有效防腐[5]，为了呈现最佳观察效果，在选取标本瓶时尽可能选择宽度及高矮合适的标本瓶，以便于日后观察。

3 结果与讨论

本实验应用化学药品和物理方法通过碱性透明液体作用于小型鱼肌体组织，使组织的折光率和透明剂的折光率相近，从而达到透明的目的。透明后的标本其骨骼（含钙部分），因硬骨部分对茜素红有较强的特异性，所以被染成玫瑰红色，软骨中具有硫酸软骨素、硫酸角质素等主要成分被阿利新蓝染成蓝色，两者轮廓清晰，颜色均匀，其他组织均呈无色透明状，因此骨骼呈现了透明后的颜色状态[6][7]。通过茜素红及阿利新蓝染色剂对两种常见鱼类的硬骨及软骨部分进行成功着色，界限清晰，且易于识别，提供了传统解剖方法不易得到的信息[8]。总体来说，一具完好的透明标本所需要的周期要根据原材料的大小、肌肉厚度以及所需的单复染色工艺等，一般完成周期在1～2个月。相信随着透明标本的不断深入研究，立足于当代科普展览中，其独特的展示方式也必将作为新的文化特色产业出现，其作用也将进一步显现出来。

参考文献：

[1]周桂凤.动物标本的分类及制作方法[J].农村经济与科技，2016，27（20）：227-229.

[2]刘万祥，蔡滢，王长月.骨骼透明标本制作及应用[J].天津医科大学学报，2002，8（3）：377-378.

[3]李忠华，王兴海.解剖学技术（第二版）[M].人民卫生出版社，1998：190-191.

[4]侯鹏高.人体透明标本制作技术及研究进展[J].齐齐哈尔医学院学报，2012，33（23）：3264-3265.

[5]黄铠，袁群芳，谢瑶，等.对比制作乳鼠骨骼染色透明标本体会[J].解剖学研究，2009，31（5）：387-389.

[6]杨小龙，王志超，何预正，等.胎儿骨骼染色透明标本的设计与制作[J].河南科技大学学报， 2011，29（2）：91-96.

[7]台红祥，王兆龙，高卫镇，等.动物骨骼透明标本制作方法的改进[J].天津医科大学学报，2014，20（6）：494-495.

[8]陈彬，王跃招.介绍一种透明骨骼标本染色法[J].生物学通报，2002，37（4）：57.