中国鲎和圆尾鲎血淋巴细胞分类和特征的比较研究

吴芳丽1黄茜枝1李琼珍2胡梦红1吕为群1王有基1

(1. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 2. 广西壮族自治区水产科学研究院, 南宁 530021)

为了更好地了解中国鲎(Tachpleus tridentatus)和圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)血淋巴细胞的种类组成和特征差异, 综合运用光学显微镜、扫描电镜和粒度仪, 较为系统地对两种鲎的血淋巴细胞进行了分类和特征研究, 从而为两种鲎的血淋巴细胞和分子生物学研究提供基础资料。根据血淋巴细胞大小、核质比、细胞着色特点、细胞中颗粒存在与否、颗粒的密集程度等, 中国鲎和圆尾鲎的血淋巴细胞均可分为大颗粒细胞、小颗粒细胞和透明细胞三种主要类型, 且两种鲎的血淋巴细胞均以颗粒细胞为主, 透明细胞在血淋巴细胞中所占比例最小, 但具有高核质比。两种鲎的同类血淋巴细胞在染色和形态上无显著性差异, 但在同一种鲎中, 血淋巴细胞密度存在显著的雌雄差异。

鲎属节肢动物门(Arthropoda)、有螯亚门(Chelicerata)、肢口纲(Merostomata)、剑尾目(Xiphosura)、鲎科(Limuroidea)[1]。全世界鲎有四种, 在我国分布的有两种, 分别为中国鲎(Tachpleus tridentatus)和圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda), 以中国鲎种群数量居多[2]。鲎在地球上已生活约4亿年, 但其形态结构却无明显变化, 仍保持原始的特点, 故有“活化石”之称, 也是海洋生物链不可或缺的组成部分。中国的鲎资源在东海及南海地区分布广泛[3, 4], 在南边以北部湾地区为界点[5, 6], 在北边以岱山为界点[7]。由于近年来环境污染严重, 加之鲎试剂行业的快速发展, 鲎资源迅速下降, 虽然目前鲎为国家二级保护动物, 但是大多数人对鲎的生物学特点及科研价值了解甚少。因此, 为了更好地保护和利用这种生物, 需要了解鲎的基础生物学特征, 并制定相应的保护措施, 以便合理地开发和利用鲎资源。我国鲎资源具有重要的价值, 主要体现为在生物链中扮演重要的角色[8], 具有重要的生态学价值; 研究发现鲎血液中含有多种特殊活性物质, “鲎试剂”的研制就是其在医学方面的重要应用[9, 10]; 此外, 还具有重要的仿生学价值和历史考古价值等。

鲎有“无脊椎动物献血冠军”的美称, 因为其体内含有大量的血淋巴, 其中含有多种活性物质, 一直是各国学者的研究的热点[11]。鲎以其天然免疫系统抵抗入侵的异物[12], 自从20世纪50年代开展了有关鲎血液细胞学的研究以及鲎试剂的研发后, 有关鲎血液活性物质的研究才相继取得了一些成就,但基础生物学研究还不够全面, 例如鲎的血淋巴细胞的分类和形态鉴定等都没有确切数据。本文首次对中国鲎和圆尾鲎的血淋巴细胞运用了光学显微镜,扫描电镜和颗粒计数仪, 较为全面和系统地对两种鲎的血淋巴细胞进行观察和分类研究, 以期为今后进一步研究中国鲎和圆尾鲎的免疫防御机制和鲎试剂的开发利用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 中国鲎和圆尾鲎的采集

成体雌性与雄性中国鲎和圆尾鲎采自中国广西北海海域。中国鲎和圆尾鲎运回实验室后, 暂养在温度(24—27)℃连续充气并配备生物活性过滤系统的玻璃纤维水族箱中(1000 L), 经过沙滤和紫外线消毒的养殖海水盐度为(30±1) ‰。暂养期间每天下午4点用蛤仔进行饲喂。适应期结束后随机选取实验用鲎, 称重并放置于独立的水箱中, 雌性中国鲎的平均重量为(700.0±10.0) g, 雄性为(250.0±20.0) g,雌性圆尾鲎的平均重量是(260.0±10.0) g, 雄性为(150.0±15.0) g, 每种鲎雌雄各选6 只作为实验材料。

1.2 血淋巴采集和总血球计数(THC)

把鲎的头胸甲与腹甲向内弯折, 用酒精棉擦拭弯折处, 再用去离子水多次擦洗[13], 用配备22 G针头的1 mL注射器从关节处插进抽取血淋巴液。每只鲎抽取5 mL血淋巴液。收集的血淋巴液储存于冰中以减少细胞自发性凝集。血淋巴液使用 MultisizerTM3库尔特颗粒计数仪(Beck man Coulter 公司)进行测定, 以确定血淋巴中细胞的浓度(每毫升的细胞数)和大小分布频率。检测时, 将0.5 mL血淋巴液加入到9.5 mL ISOTON®II溶液中, 检测1000 µL的混合溶液计算其中的细胞个数, 使用 MultisizerTM3软件分析数据 (Beck man Coulter, Inc. USA)。

1.3 细胞光学显微镜分析

中国鲎和圆尾鲎分别抽取血淋巴后, 将 50 µL血淋巴液滴在 Super Frost Plus载玻片上(Men zel-Germany)。当血细胞黏着在玻片上后, 将其浸泡于戊二醛溶液(2%浓度; 无菌海水配制, FSSW)中静置20min, 然后用曙红亚甲基蓝II染液(0.2 mL曙红溶液和2 g亚甲基蓝定容100 mL 95%酒精溶液中)进行染色6min。接着, 将玻片转移到Giemsa染液(吉姆萨粉(Giemsa stain) l.0 g, 甘油(AR) 66 mL, 甲醇(AR) 66 mL, 将Giemsa粉放入研钵中, 先加入少量甘油,研磨至无颗粒为止, 然后再将全部甘油倒入, 放56℃温箱中2h后, 加入甲醇, 将配制好的染液密封保存棕色瓶内, 于 0—4℃保存)中浸泡染色 30min,再用磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.5)冲洗, 直至流下的液体变透明为止, 后于空气中自然风干。经过染色处理后, 中国鲎和圆尾鲎血淋巴细胞中的酸性颗粒物质被染成粉红色, 碱性颗粒物质被染成蓝色。玻片用中性树胶封片剂(Fisher Scientific,USA)封片,并置于光学显微镜下观察(Axioplan 2 Imaging,Carl Zeiss, Germany)。显微图像使用Color-View II CCD摄像机(Olympus/Soft Imaging System, Germany)拍摄。血细胞及细胞核的直径用图像分析软件(Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Germany)进行测量。

1.4 细胞扫描电子显微镜分析

取中国鲎和圆尾鲎的血淋巴液各 50 µL, 分别放于 Super Frost Plus载玻片上(Men zel-Glaser, Germany), 并置于保湿室内在室温条件下静置 25min让细胞黏附。黏附的细胞置入含4%多聚甲醛, 2.5%戊二醛以及0.3 mol/L蔗糖的0.1 mol/L的二甲砷酸盐缓冲液(pH 7.2)中2h。随后用0.1 mol/L的二甲砷酸盐缓冲液进行冲洗, 再用含 1%四氧化锇的0.1 mol/L的二甲砷酸盐缓冲液进行固定, 在不同浓度的乙醇溶液(30%, 50%, 70%, 80%, 95% 和100%)中进行脱水处理, 最后浸泡在丙酮中。脱水后的样品在CO2环境中(BAL-TEC CPD 030 Critical Point Dryer, Liechtenstein)进行干燥, 置于铝座上用BALTEC SCD 005 Sputter Coater (Liechtenstein)喷涂金-钯层, 用FEI/Philips XL30 Esem-FEG 扫描电子显微镜(Netherlands)调节于10 kV观察。

1.5 统计分析

在进行数据分析之前, 所有数据使用SPSS 16.0进行 Shapiro-Wilk’s检验检查正态分布性, 用Levene’s检验检查方差齐性。百分比数据在分析前进行反正弦转换。核质比(Karyoplasmic ratio), 即N/C,为细胞核直径与细胞胞质直径的比值。为了更好的比较两种鲎之间、性别之间、同种亚群之间的特点, 使用student t检验和单因素方差分析(ANOVA)进行分析检验。以P＜0.05代表差异显著, 结果表示为平均值±标准差。

2 结果

2.1 血淋巴细胞的光学显微镜观察

中国鲎和圆尾鲎的血淋巴细胞涂片经过染色以后, 在光学显微镜下呈现出各种单独的或聚合的细胞, 并显示出不同的颜色和大小(图1)。大量细胞表现出丰富的红色颗粒和少量的蓝色颗粒, 形状基本为卵形或圆形, 中间蓝色部分为细胞核。根据传统的细胞染色分类标准, 这些细胞称为颗粒细胞。颗粒细胞根据细胞及颗粒的密度大小又可进一步分为两种类型, 即大颗粒细胞和小颗粒细胞。大颗粒细胞内部颗粒较致密、染色较深, 小颗粒细胞内部颗粒较稀疏, 染色较浅。在光学显微镜下还可以观察到另外一种类型的细胞, 这种细胞体积较小, 内部含有很少的颗粒物质, 有的甚至观察不到染色颗粒物质, 但是细胞中有被蓝色染料染色的细胞核, 核的周围有一圈透明的细胞质, 这种细胞称之为透明细胞或无颗粒细胞。透明细胞呈现出较大的核/质比和淡蓝色的细胞质背景(图1), 可以观察到一定程度的细胞聚集现象(图2)。

表1显示出雌雄性中国鲎和雌雄性圆尾鲎血淋巴细胞各亚群间细胞核直径、细胞直径以及核质比。雌性中国鲎和雌雄性圆尾鲎的3种类型的血淋巴细胞的长径都存在显著性差异, 雄性圆尾鲎的大颗粒细胞和小颗粒细胞的长径不存在显著性差异, 但总体都是大颗粒细胞长径＞小颗粒细胞长径＞透明细胞长径; 雌性中国鲎和雌性圆尾鲎的大颗粒血淋巴细胞长径和无颗粒血淋巴细胞长径不存在显著性差异(图 3a)。雌雄性中国鲎和雌雄性圆尾鲎的3种类型的血淋巴细胞的短径都存在显著性差异, 且总体都是大颗粒细胞短径＞小颗粒细胞短径＞透明细胞短径;雌性中国鲎和雌性圆尾鲎的3种类型的血淋巴细胞短径不存在显著性差异(图3b)。

图1 中国鲎和圆尾鲎血淋巴细胞的光学显微图Fig. 1 Light micrographs of hemocytes of Tachpleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda

图2 中国鲎和圆尾鲎透明细胞的聚集现象Fig. 2 Aggregates of the hyaline cells in Tachpleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda

雌雄性中国鲎和雌雄性圆尾鲎的大颗粒血淋巴细胞核长径之间不存在显著性差异, 小颗粒血淋巴细胞核长径也是如此; 中国鲎和圆尾鲎的透明细胞核长径之间存在显著性差异, 但是同种鲎雌雄性间的透明细胞核长径不存在显著性差异(图 3c)。雌雄

图3 中国鲎和圆尾鲎各亚群血淋巴细胞直径数据分析

Fig. 3 The cell diameters of each hemocyte subpopulation in Tachpleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda

a. 中国鲎和圆尾鲎各亚群血淋巴细胞长径数据分析; b. 中国鲎和圆尾鲎各亚群血淋巴细胞短径数据分析; c. 中国鲎和圆尾鲎各亚群血淋巴细胞核长径数据分析; d. 中国鲎和圆尾鲎各亚群血淋巴细胞核短径数据分析; e. 中国鲎和圆尾鲎各亚群血淋巴细胞核质比数据分析; 不同小写字母表示同一种鲎中三种细胞之间具有显著性差异(P＜0.05), 不同大写字母表示每种细胞在四类鲎之间存在显著性差异(P＜0.05)

a. The long diameter of hemocyte subpopulations; b. The short diameter of hemocyte subpopulations; c. The long diameter of nucleus in hemocyte subpopulations; d. The short diameter of nucleus in hemocyte subpopulations; e. The N/C retio of hemocyte subpopulations. Different small letters indicate significant difference among three types of cells in each species, and different capital letters indicate significant difference among four different species

GC: 大颗粒细胞; SGC: 小颗粒细胞; HC: 透明细胞; HSCF: 雌性中国鲎; HSCM: 雄性中国鲎; YHSCF: 雌性圆尾鲎; YHSCM: 雄性圆尾鲎

GC: the granular cell; SGC: the semi-granular cell; HC: the hyaline cell; HSCF: the female Tachpleus tridentatus; HSCM: the male Tachpleus tridentatus; YHSCF: the female Carcinoscorpius rotundicauda; YHSCM: the male Carcinoscorpius rotundicauda性中国鲎和雌雄性圆尾鲎的大颗粒血淋巴细胞核短径之间都不存在显著性差异; 中国鲎和圆尾鲎的小颗粒血淋巴细胞核短径之间不存在显著性差异, 透明细胞的核短径也是如此, 但是同种鲎雌雄性间这两种细胞核短径之间不存在显著性差异(图 3d)。雌雄性中国鲎和雌雄性圆尾鲎的3种类型的血淋巴细胞的核质比都分别存在显著性差异, 且总体都是透明细胞核质比＞小颗粒细胞核质比＞大颗粒细胞核质比(图3e)。

表1 中国鲎和圆尾鲎的总血球计数和细胞体积与表面积Tab. 1 The number and distribution of the hemocytes in Tachpleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda

2.2 总血球计数

使用库尔特计数法对中国鲎和圆尾鲎雌雄类别中的总血球进行了计数和细胞频率分布评估(表1)。中国鲎雌性血淋巴细胞浓度为(3.89±1.13)×106cell/mL,中国鲎雄性血淋巴细胞浓度为(2.16±0.12)×106cell/mL;圆尾鲎雌性血淋巴细胞浓度为(3.27±1.32)×106cell/mL,圆尾鲎雄性血淋巴细胞浓度为(1.73±0.28)×106cell/mL,总体来说, 中国鲎和圆尾鲎都是雌性的血淋巴细胞浓度大于雄性的, 同种性别的中国鲎和圆尾鲎间血淋巴细胞浓度不存在显著性差异。

细胞大小的频率分布表明, 雌性中国鲎和圆尾鲎的细胞直径范围为 6.0—20.0 µm, 峰值在 11—13 µm; 雄性中国鲎和圆尾鲎的细胞直径范围为6.5—19.0 µm, 峰值在11.5—14 µm。雌性中国鲎细胞表面积介于 200—2.4×106µm2, 雄性中国鲎细胞表面积介于50—1.2×106µm2; 雌性圆尾鲎细胞表面积介于 200—2.0×106µm2, 雄性圆尾鲎细胞表面积介于50—1.0×106µm2。总体来说, 雌性中国鲎大多集中在5.0×105—1.8×106µm2, 雌性圆尾鲎最多集中在5.0×105—1.5×106µm2, 雄性中国鲎和圆尾鲎最多集中在3.0×105—8.0×105µm2。中国鲎和圆尾鲎细胞体积与细胞表面积的分布趋势相同, 雌性中国鲎和圆尾鲎的血淋巴细胞体积较雄性的大, 雌性中国鲎大多集中在6.0×105—2.5×106µm3, 雌性圆尾鲎最多集中在5.0×105—1.5×106µm3, 雄性中国鲎和圆尾鲎最多集中在2.0×105—2.0×106µm3。

2.3 血淋巴细胞的扫描电子显微镜观察

通过扫描电镜对中国鲎和圆尾鲎的雌性以及雄性血淋巴细胞分别进行了观察, 发现了 3种在细胞形态上有明显区别的细胞类型, 包括: (1)体积较大的细胞, 表面有瘤状突起以及一些凹槽, 有些呈饼状, 分析认为是大颗粒细胞; (2)体积较1类细胞小,表面有瘤状突起, 一般呈球形, 比较规则, 分析认为是小颗粒细胞; (3)细胞体积较1、2类都小, 有连续的变形的突起, 细胞有褶皱的表面, 基本呈球形,分析认为是透明细胞(图4、图5)。测量发现大颗粒细胞直径为(10.0±1.1) µm, 小颗粒细胞直径为(7.8± 0.4) µm, 透明细胞直径为(6.0±0.5) µm。

3 讨论

鲎的血淋巴系统异常复杂, 为节肢动物最复杂的心血管系统[14], 至今各国学者对鲎血淋巴细胞的种类看法不一, 其主要原因是: 首先, 很难建立统一的血细胞的分类标准。第二, 由于血细胞种类的多样性, 所采用的研究手段也不尽相同。尽管在无脊椎动物血淋巴细胞的分类方面存在一些争议, 但是大多数学者都认同水生无脊椎动物血细胞分为两个主要类别: 一类是细胞中有颗粒的粒细胞, 另外一类是含有少量或是没有颗粒的透明细胞。这两种类型在本研究中都有观察到, 经Giemsa染液染色后, 3种不同细胞亚群被鉴别出来, 包括 2种粒细胞和一种无颗粒细胞。染色表明, 颗粒细胞大多数是嗜酸性的, 而无颗粒细胞呈嗜碱性。鲎血淋巴细胞主要为颗粒性细胞, 其胞质中含有众多的大小颗粒,鲎的血淋巴细胞中含有多种免疫因子, 大部分存在于这些颗粒中, 这些免疫因子在鲎的天然免疫中起着重要的作用[14, 15]。粒细胞和透明细胞的区别通过光学显微镜很容易观察到。但是要对颗粒血细胞的不同种类进行细分需要关注更多细节, 用扫描电镜来进行血细胞的研究对细胞的分类起到一定的补充和验证作用, 而且能够提供精确的关于细胞表面的信息和特征。因此, 对于中国鲎和圆尾鲎血细胞的研究, 在使用光学显微镜确定大致的血细胞的种类后, 可以进一步用扫描电镜来检验不同类型细胞的表面特征和验证在光学显微镜下的细胞类群鉴定。

图4 中国鲎血淋巴细胞的扫描电子显微图Fig. 4 Scanning electron micrographs of hemocytes of Tachpleus tridentatus

图5 圆尾鲎血淋巴细胞的扫描电子显微图Fig. 5 Scanning electron micrographs of hemocytes of Carcinoscorpius rotundicauda

在光学显微镜下通过染色后可以根据细胞的内部结构和细胞大小来区分不同的血细胞。染色结果说明了粒细胞中的大部分颗粒都是嗜酸性的, 与细胞的亚群类型无关。基于光学和电镜显微分析, 细胞呈现不同的大小和内部粒度, 又可以将颗粒血细胞分为两个亚类, 即大颗粒细胞和小颗粒细胞。中国鲎和圆尾鲎的大颗粒细胞核质比一般在 0.3—0.4,而小颗粒细胞核质比在 0.4—0.5。透明细胞与颗粒血细胞的不同主要表现在高核质比和小体积, 颗粒血细胞会出现较多的染色颗粒, 细胞质着色清晰,且核质比较透明细胞小很多, 这种现象在其他的一些水生无脊椎物种上也同样存在[16, 17]。

对中国鲎和圆尾鲎的3种血淋巴细胞在扫描电镜下观察到的基本形态与在光学显微镜下观察到的形态基本相符, 扫描电镜结果主要强调细胞的表面结构, 最小的球形细胞对应了光镜下所观察到的透明细胞; 在扫描电镜下观察到的体积较大且有一些瘤状突起的球状细胞是小颗粒细胞, 因为在光学显微镜下观察到这类细胞体积中等且细胞内有一定的颗粒密度但不是特别充盈; 而在扫描电镜下观察到的体积最大, 细胞表面有凹槽及瘤状突起且呈饼状,这种细胞极有可能是大颗粒细胞。相比之下高密度的粒细胞由于内部颗粒较多且粒度差异性较大, 其表面由于颗粒的支撑看上去凸起较多且饱满, 凹槽也比较清晰, 这是因为这种细胞内部充满了颗粒,所以细胞内部没有多余的空间。而小颗粒粒细胞由于细胞内颗粒的充盈度不是特别高, 其表面略微形成一些褶皱。在扫描电镜下可以看到透明细胞呈现出一种特别的状态, 细胞表面有很多皱褶, 这是由于内部的颗粒非常少。

总血球计数结果表明, 中国鲎和圆尾鲎的血淋巴细胞数量不是固定的。众多因素, 包括外源性(如水温、污染物、盐度、地理位置)和内源性(如性别、年龄、动物的生育期)可以影响中国鲎和圆尾鲎的血淋巴细胞总数和各亚群的比例, 这些结论已在多种水生无脊椎动物血淋巴细胞的研究中得到验证[18—20]。在本研究中, 两种鲎来自广西北海北部湾地区, 外在环境条件基本一致, 其总血球数的变化主要归因于内源性因素, 如年龄和性别等。相比传统的血球计数板法, 本研究总血球计数由库尔特计数器评估,具有更高的精确度和便捷性。

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