河豚毒素的性质及应用研究进展

王纯纯，乔 琨，陈 贝，许 旻，黄鹭强*，刘智禹*

(1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350108；2.福建省水产研究所，国家海水鱼类加工技术研发中心，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013)

河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种非蛋白高毒性的天然海洋活性物质，于鲀科鱼(Tetraodontidae)中发现，因此命名为河豚毒素。TTX主要分布于鲀鱼的内脏，不同河鲀间分布差异较大。TTX毒性极强，小鼠腹腔注射的半致死剂量(LD50)仅为 10.7 μg/kg[1]，且稳定性强，一般的处理方式难以降解其毒性。TTX还是一种特殊的选择性钠离子通道阻断剂，现研究热点多集中于应用于麻醉、戒毒、治疗神经类疾病[2]。河鲀味美，但慕名者发生中毒事件屡出不穷，且目前尚无有效的解毒剂。了解TTX的性质对开放河鲀鱼市场及保障人类生命安全有着重要的生物学意义，研究TTX的应用可以充分利用TTX的特殊性质，拓宽河鲀的应用效益途径。本文结合近年TTX的研究进展提出展望，为深入研究TTX的性质及应用提供参考资料。

1 河豚毒素简介

1.1 TTX理化性质

TTX是许多生物体内含有的一种天然非蛋白毒素，由一个带有三环正酯的四环骨架和一个环胍部分组成[3]。河豚毒素分子通过胍基与氮原子的质子化形成的阳离子和正羰基的离解作用形成的阴离子相互结合成内盐[4]。TTX粗品为黄褐色粉末，纯品呈白色晶体状，易潮解，极易溶解于稀酸水溶液，亲水性强，呈弱碱性(pKa为8.76)，分子式为 C11H17O8N3，分子量仅为319，属于氨基全氢喹唑啉化合物。TTX在溶液中有三种结构变化(TTX、内酯型 TTX、半缩醛型 TTX)，TTX理化性质稳定性强，在酸性和中性条件下均具有热稳定性，高温下毒性增强；碱性条件下TTX在90℃～100℃与5%氢氧化钾溶液作用分解成C9碱，可通过其荧光发色基团进行TTX的化学检测[5]。

1.2 河豚毒素的致毒机理

电压门控钠离子通道是一种跨膜蛋白，在细胞电信号中发挥重要作用。其活性受细胞膜电位的调节，开放的通道允许离子沿电化学梯度在细胞膜上移动。TTX的胍基在人体内发生了质子化而带上正电，因此能够结合电压门控钠通道，结合钠离子通道侧链上带负电的羰基导致钠离子无法进入通道。TTX能与钠离子通道受体特异性靶分子结合位点Ⅰ结合，使得钠离子无法进入离子通道中，其阻塞造成神经兴奋传导速率减慢，从而间接影响神经中枢和神经末梢，引起麻痹、血压下降。摄入河豚毒素的中毒患者终因呼吸麻痹引起呼吸衰竭而死亡[6]。一些研究人员研究了TTX对小鼠和兔子的毒性。小鼠腹腔注射、皮下注射和灌胃给药毒素的半致死剂量(LD50)分别为10.7、12.5、532.0 μg/kg，发现雄性小鼠对TTX更敏感。另一方面，肌肉注射和静脉注射的兔子的最小致死剂量(MLD)分别为5.3、3.1 μg/kg，而致死剂量(LD)分别为5.8、3.8 μg/kg。此外，经腹腔注射TTX对小鼠的毒性比口服TTX高约50倍[1]。

2 河鲀体内河豚毒素的来源

TTX广泛存在于各个物种中，分布呈现特异性、地域性、季节性等特点，其共性是与水生生态高度相关。因此关于河鲀体内TTX的来源目前出现了两个争端，分为外源性起源和内源性起源。外源性是指来自食物网摄入产生毒素的途径。内源性则是指含有毒素的生物体自身合成毒素的途径。

2.1 河豚毒素在河鲀中的分布

河鲀是中国海域中常见的有毒鱼种，TTX分布于大部分有毒河鲀中(表1)。TTX含量与河鲀品种、组织、季节显著相关，亲缘关系较近的河鲀鱼种体内TTX含量相似[7]。一般，河鲀组织器官中毒性较强的有卵巢、肝脏和皮肤，精巢和肌肉毒性较低甚至无毒。但河鲀种间组织分布差异性极大，且在不同捕捞季节检出的毒性大小也不同[8]。卢义博等[9]通过灌胃实验分析TTX在暗纹东方鲀不同组织器官中的转移分布规律，各个器官对TTX有不同的作用功能，如肠道作为摄食的屏障阻碍TTX的吸收，因此在灌胃初期会检测到大量TTX，随时间延长，TTX含量下降，TTX转移到肝脏、皮肤、肌肉、性腺等组织中；鳃是河鲀排泄的主要器官，所以TTX含量极小；幼年河鲀的TTX主要蓄积在皮肤，成年河鲀则主要蓄积在肝脏，性成熟后TTX转移到卵巢；TTX转移至代谢器官(胆囊、脾脏、肾脏)前浓度先升高后下降，推测这些器官在TTX的代谢和消除前期都发挥了重要作用。

表1 河豚毒素在河鲀体内的分布情况

续表1

2.2 内源性起源学说

主张内源性起源的学者认为河鲀体内的毒素是通过河鲀体内某种特殊的机制或由微生物将摄入的食物反应而生成毒素。但是始终没有相关证据证实这一学说的真实性，因此该学说不被大众认可[37]。Matsumura K[38]证明了河鲀具有产生河豚毒素的能力，通过对剧毒的河鲀卵母细胞进行人工授精和培养，发现胚胎的毒素水平随着发育而不断增加，这表明胚胎在发育过程中增加的河豚毒素是胚胎的产物，因为胚胎不太可能从培养液中摄取毒素。对于河豚毒素的随机性，Tanu M B等[39]提出一种观点，他认为河豚毒素在生物体内以一种无毒的前体或类似物形式存在，而生物体在自身体内微生物的作用下以及外界环境的影响下将其转化为剧毒的河豚毒素。

2.3 外源性起源学说

早在1982年Matsui T等[40]就发现河鲀在孵化后用无毒饲料人工饲养时变得无毒，从此开启了外源性起源学说的研究热潮。2006年研究人员发现网箱养殖或陆养可获得无毒的河鲀，也验证了河豚毒素来源于摄食[41]。在封闭环境下，河鲀被喂养无毒饲料后，检测发现其不产生毒性，而无毒河鲀口服有毒饲料后能迅速积累TTX[42]，进一步补充了TTX来源于外界的证据。另外，研究人员利用免疫组织化学技术，将河鲀的组织切片放入含有TTX的培养液中，发现组织切片能够摄入TTX，有利地证明组织不能分泌TTX，而是吸收体外的TTX[43]，且通常大多数河鲀鱼的消化道是检测到TTX含量最多的组织[25]，而消化道是摄食的第一道屏障；这些发现不仅证实TTX是来源于体外，还揭示了食物链这一来源途径。

许多研究人员认为从海洋和淡水沉积物中分离的TTX产生菌通过食物网在小型浮游动物和碎屑喂食者体内积累毒素，从而在大型动物体内积累毒素[44]。最近平角涡虫(Planoceramultitentaculata)已被认为是河豚毒素在海洋动物体内积累的重要中间体，为细菌生产者和脊椎动物体内携带河豚毒素的物种提供了重要的联系[45]。TTX分布于平角涡虫的所有三个系统发育类群(古线虫、竹节线虫和线虫)的各个属当中。其中特别令人感兴趣的是头孢菌属的线虫，它可以积累极高数量的TTX，这使它们具有与河鲀相同的毒性水平[46]。实验证明，拟头孢菌素提取物对TTX有很强的毒性相关作用[47]。TTX产生菌的种类和数量在不断增加，已报道的菌株大多属于弧菌属(Vibrio)。除弧菌外，产生TTX的细菌种类较多，包括假单胞菌、芽孢杆菌、气单胞菌、放线菌、沙雷氏菌、微杆菌和希瓦氏菌[48]。

河豚毒素是一种生物二级代谢物，而微生物种间的相互协调会影响微生物次级代谢物的生产，次生代谢物的生物合成途径对于阐明河豚毒素的遗传基础至关重要[49]。目前微生物分离出的TTX含量极低，仅为ng级别，且暂无特定技术能够证明TTX来源于微生物，由此可知河鲀体内的TTX并非完全来源于微生物，可能与微生物种间或微生物与机体相互协调有关。这些途径主要由编码特定酶的基因的转录活性控制，这种酶进一步编码在细菌基因组中[50]，即表达毒素生物合成途径的基因聚集在细菌基因组中。因此，关注细菌基因组可以更容易地理解TTX的起源和产生。

3 河豚毒素的耐受与富集

3.1 河豚毒素结合蛋白

含有TTX的生物体是如何抵抗TTX高毒性而存活的？其在体内富集的途径是怎样的？解答这两个问题，主要考虑两方面的因素。第一，河鲀体内存在河豚毒素结合蛋白，它消除了毒素的影响，同时这一物质还起到了转运毒素的作用。第二，钠离子通道关键性氨基酸的改变，使得TTX失去作用靶点，无法致毒。

2000年Matsui T等从星点东方鲀血浆得到一种河豚毒素结合蛋白，其与TTX结合能力高达66%，但其仅在中性pH条件下通过特异性结合才能有效抵御来自TTX的伤害[51]。2001年Shoji Y等[52]从河鲀(Fugupardalis)血浆中分离出一种具有可溶性且能与石房蛤毒素(STX)和TTX结合的二聚体糖蛋白，被称为PSTBP(Pufferfishsaxitoxin and tetrodotoxin binding protein)，与Matsui T等[51]发现的河豚毒素结合蛋白同源。随后在2013年Yotsu-Yamashita M等采用免疫组织化学方法研究了PSTBP在豹纹多纪鲀肠道、肝脏、卵巢、皮肤和骨骼肌中的分布规律，推测PSTBP是TTX在组织间，特别是肝脏、卵巢和皮肤之间转移的载体蛋白，PSTBPs定位于TTX分泌腺周围的真皮而后向腺体运输和提供TTX[53]。Satone H等[54]研究了重组红旗东方鲀河豚毒素结合蛋白I型和 Ⅱ 型(rTrub.PSTBP1和rTrub.PSTBP2)分别与TTX和石房蛤毒素(STX)的结合能力，两种蛋白都与三丁基锡结合，但在热变性时失去了这种能力，只有rTrub.PSTBP2在热变性的条件下也能与TTX结合，这一现象提示PSTBP2的氨基酸序列可能与TTX的亲和力有关。Yotsu-Yamashita M等[55]在2018年调查了除东方鲀以外的四种有毒河鲀[黑斑叉鼻鲀(Arothronnigropunctatus)、纹腹叉鼻鲀(A.hispidus)、菲律宾叉鼻鲀(A.manilensis)、凹鼻鲀(Chelonodonpatoc)]中PSTBP类似物的存在，结果表明PSTBP不是东方鲀属特有的蛋白，同时也分布在有毒河鲀的其他属。Qiao K等[56]在2021年克隆了来自菊黄东方鲀卵黄蛋白原的cDNA，重组表达蛋白产物与TTX结合可以有效降低毒性，且河鲀体内不同组织和发育阶段的卵黄蛋白原表达差异表明，结合蛋白可参与TTX的转运。这些研究均表明PSTBP及其类似物与有毒河鲀体内TTX的积累有关。河豚毒素结合蛋白在河鲀体内组织分布的丰富度以及与毒素含量的高度相关性，可以推测这类蛋白可以作为转运蛋白来帮助河鲀抵御毒性。

3.2 钠离子通道蛋白氨基酸突变

TTX阻止钠离子通过细胞膜进行移动，并通过与神经和肌肉中电压门控钠通道的外孔结合来阻止控制神经冲动的动作电位。对TTX耐受动物的钠通道蛋白关键位置或外孔中其他位置的氨基酸被替代，抑制了与TTX的结合而改变了这一致毒机制，从而产生TTX抗性。TTX耐受生物在电压门控钠通道基因中包含多个突变，每个突变都有助于提高对TTX的抗性。

含有TTX的河鲀体内电压门控钠通道Ⅳ-α亚单位(SCN4a)发生了突变，TTX与通道的亲和力显著降低，相差15倍[57]。除了河鲀外，研究动物模型中最经典便是蝾螈和吊带蛇，两者在长期军备竞争共同进化中逐渐衍生出TTX抗性，吊带蛇的TTX抗性似乎具有相对简单的遗传基础，作为TTX分子靶标的肌肉和神经中表达的钠通道外孔(P环)发生结构变化。骨骼肌钠通道(Nav1.4)的功能变异对于促进整个动物的TTX抗性显得尤为重要[58]，编码该蛋白(SCN4a)基因的等位基因变异似乎是造成吊带蛇属(剑纹带蛇、海岸带蛇)种群内部和种群之间表型巨大差异的原因[59]。还有一有利的证据便是生物体表现出来的生理变化，对TTX抗性最强的剑纹带蛇Nav1.4中氨基酸发生了置换，因该置换减少了TTX与骨骼肌钠通道的连接，损害了离子通道功能，所以剑纹带蛇的爬行速度较慢[60]。

4 河豚毒素的应用

TTX作为一种治疗药物具有重要的属性，对电压依赖性钠离子通道(Voltage-gated sodium channels，VGSCs)的高度特异性、选择性阻断Na离子通道、无法穿越血脑屏障，因此TTX应用范围广泛。

1)戒毒：TTX可减轻急性海洛因戒断综合征，可能是由于其对外周钠通道的影响。许多研究表明，戒断症状与阿片类、中枢胆碱能、中枢肾上腺素能、中枢多巴胺受体有关。TTX是可逆的钠通道传导的选择性抑制剂，可以阻断神经传导，进而影响递质释放的效率[61]。2001年Chen S Q等[62]发现使用TTX可抑制大鼠和小鼠的吗啡戒断症状，给药过程中没有改变麻醉大鼠中的心率、血压和呼吸率。2009年Shi J等[63]首次采用随机、双盲、安慰剂对照研究TTX对戒断海洛因的能力，受试者在戒断过程中减少了焦虑和渴望等症状。TTX用于戒毒不仅能够有效减轻戒断症状，还不会影响戒毒者的心肺功能，具有良好的应用前景。

2)镇痛：TTX是一种能阻断神经元上的电压门控钠通道的小分子，通过引发和传导外周神经系统中的脉冲来抑制镇痛。有新的临床实验表明患者以4 d为一个治疗周期使用TTX后，镇痛效果可延续一周甚至长达一个月，其机制可能是由于位于伤害性神经元外围的Nav1.7部分钠离子通道发生了堵塞[64]。与一般的镇痛药不同，TTX不会引起直接的心肌抑制，并且穿过血脑屏障的能力较差，因此降低了癫痫发作和中枢神经系统受损的风险。加拿大已在进行TTX临床Ⅲ期试验，将其作为针对治疗癌症晚期发作的癌性疼痛的全身镇痛药，尤其是针对神经性疼痛[65]。

3)麻醉：背根神经节(Dorsal root ganglion，DRG)是外周伤害感受性信号传入的重要中转站，其表达多个钠离子通道，如NaV1.7～NaV1.9、NaV1.3 和 NaV1.1，而TTX可高效阻断NaV1.7、NaV1.3、NaV1.1。TTX亲水性强，透过血脑屏障、血-脊髓屏障可能性极小，因此作为局部麻醉剂有极大的优势。此外，与一般麻醉剂相比较，TTX对心脏、局部神经、肌肉的毒性极小。但TTX神经毒性大，药物安全性低，因而限制了其作为局部麻醉剂的应用。研究人员多年来致力于提高TTX用药的安全性，目前有两种方式：(1)与肾上腺素能药物一同使用，可降低TTX的整体有效毒性，且麻醉时间可以延长；(2)延迟药物的释放，可显著延长TTX暴露于神经的时间，并可保持局部高浓度。其中最普通的靶向给药方式就是与可降解的聚合物颗粒结合，构建可控的药物递送体系。另外，远程触发药物递送系统，利用脂质体包裹TTX，以外界安全的触发手段(电磁场、超声波、红外光)产生热量，使药物释放[66]。Zhao C等[67]将TTX与可生物降解的聚合物通过可水解的酯键共价结合，可防止TTX的起始释放，酯键缓慢水解可控制TTX释放速率，使得TTX精准地投入到目标组织中。研究人员还利用化学渗透增强剂(CPEs)来增强TTX对神经的渗透，提高药物的有效性，从而减少TTX的用量，提高用药的安全性。

4)治疗失眠：微量注射TTX，脑桥区的活性降低，导致快速眼动睡眠时间和非快速眼动睡眠时间减少，证明TTX影响生物的睡眠-觉醒状态[68]，有治疗失眠等睡眠问题的潜能。

5)抗心律失常：抗心律作用机制为TTX阻断钠通道后，使快反应细胞膜和心肌细胞膜的最大除极速率显著降低，快反应组织的自律性降低，传导减慢、不应期延长，因此心率得到抑制、心脏室颤拮抗。微量TTX与市面上的抗心律失常药剂联用，可增强药效[69]。

6)作为抑制病毒主要蛋白酶的有效化合物：SARS-CoV-2的主要蛋白酶(Mpro)是介导病毒复制和转录的关键酶，Law W Y等[70]通过计算机辅助药物设计筛选发现TTX是抑制SARS-CoV-2Mpro的有效活性化合物。

7)研究辅助标准：TTX是著名的特异性钠通道阻断剂，TTX直接或间接地影响着生命维持的重要活动，TTX仅与VGSC结合，因此，它是几十年来研究人员用来表征VGSC结构和功能的黄金标准，包括区分河豚毒素敏感(TTX-IC50～10 nm)和河豚毒素耐药(TTX-IC50≥1μmol/L)VGSC[71]。如Chen L等[72]发现TTX敏感钠离子电流密度和Nav1.6是介导长春新碱用于化疗中引起疼痛周围神经病变的关键，对于研究疼痛机制以及各类神经有着重要的帮助。

5 总结与展望

TTX是一种极具价值和研究意义丰富的天然物质，其毒性与神经系统密切相关的联系是研究的热点。关于TTX的来源，外源学说支持的证据较多，推测为主要产生途径；内源学说证据较为单薄，怀疑是河鲀体内某种物质复杂反应的偶然性结果，有待进一步考证。TTX从外来摄入物质到体内的转运机制以及过程中发生的化学反应，通过何种途径代谢，暂无相关解释。河豚毒素结合蛋白的研究集中于分离、体外结合能力的测定及进化的相关基因等方面，但结合后的蛋白在体内如何作用、代谢、转运都没有具体的研究。

钠离子通道蛋白特定位点氨基酸突变推测对生物体耐受TTX起到了重要作用。近期，Shen H Z等发现TTX与STX通过与Nav通道孔区的选择性滤器结构域形成大量的氢键，使其能稳定的堵在孔区，从而阻断了钠离子正常通过选择性滤器的通路[73]。这一突破揭示了TTX较认知中更复杂的毒性机制，钠离子通道的选择性识别机制还未有探索，耐受TTX动物体内钠离子通道蛋白结构仍未有具体解析，因此TTX的耐受机制仍待进一步完善。

TTX具有极高的医疗价值，在药物缓释体系发展的逐渐进步中克服了其本身的临床受限，并且在麻醉镇痛方面取得了一定的成效。目前改善TTX治疗指数的思路应集中于增强其与神经的作用放大疗效、减慢释放的速率、精准定位作用靶点。河豚毒素与神经系统的密切联系可为许多疾病的治疗提供新的思路及研究方向。

据此，TTX未来研究发展总结为四个方面：(1)分离合成更多未报道过的河豚毒素结合蛋白，解析其与TTX复合蛋白的具体结构，了解其具体作用机制；(2)探究钠离子通道选择性识别机制，深入了解TTX识别结合过程，突破利用TTX作为药用的瓶颈；(3)研究TTX及其代谢物的基因表达情况，明细其信号因子调控模式，才能做到真正溯源；(4)丰富TTX的应用，必须提高TTX的治疗指数，可研发新的药物载体，优化其性能，以争早日实现“反毒为药”。